Lezione 19 20 marted 3 maggio 2011
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Lezione 19 - 20 martedì 3 maggio 2011. corso vettori biologici II Biotec industriali ore 14:00 -16:00 aula 6A. vettori con integrazione. vantaggi : controllo di espressione e funzione con ripetibilità Svantaggi : più laboriosi per selezionare l’integrazione

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Lezione 19 - 20 martedì 3 maggio 2011

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Presentation Transcript


Lezione 19 20 marted 3 maggio 2011

Lezione 19 - 20martedì 3 maggio 2011

corso vettori biologici II

Biotec industriali

ore 14:00 -16:00 aula 6A


Vettori con integrazione

vettori con integrazione

vantaggi : controllo di espressione e funzione con ripetibilità

Svantaggi : più laboriosi per selezionare l’integrazione

Mediazione da sistemi semplici di procarioti o lieviti


Ricombinazione random e specifica

Ricombinazione random e specifica

Dalle Cellule procariotiche alle eucariotiche

Trasfezione transiente trasfezione stabile

trasfezione stabile = ricombinazione stabile

Ricombinazione random ricombinazione sito specifica

Obbiettivo: riuscire ad avere una espressione o un KO di un gene in condizioni controllate


Vettore classico per integrazione sito specifica

Vettore classico per integrazione sito specifica

modello :  omega ma non è l’unico

modello n. 4 Giuditta


Perch omega

Perché Omega

Sono stati fatti vari modelli: O circolari con un solo X-over

Non ci sono grandi differenze di efficienza misurata sulla ricombinazione omologa sul gene per la

HPRT ipoxantina-tioguanina fodforibosil-transferasi

omega : le due spalle per la ricombinazione omologa

neo

tk

a

b


Frequenza di ricombinazione

frequenza di ricombinazione

  • Frequenza di ricombinazione bassa ~1x10-6

  • Il metodo è possibile applicarlo solo con numeri grandi di cellule su cui fare una selezione per selezionare i ricombinanti

  • Cellule eucariotiche in coltura (almeno 50-100 x 106 )

  • Metodo essenziale per avere animali transgenici KO

  • o knock - in

  • solamente se sono disponibili metodi per avere gameti o cellule staminali totipotenti trasformabili col vettore per ricombinazione omologa


Cellule embrionali es di topo

Cellule embrionali ES di topo

Solo da quando sono state disponibili in coltura le cellule embrionali staminali di topo è stato possibile provare a fare la ricombinazione omologa per avere topi transgenici ricombinanti su sito specifico

Topi transgenici precedenti erano solo per inserzione random e quindi solo per espressione di geni esogeni o sovrannumerari


Si ottengono solo eterozigoti

Si ottengono solo eterozigoti

Il topo transgenico nato da trasformazione della blastocisti è sempre eterozigote

sia con ricombinazione random che sito specifica

Inutile cercare di ottenere doppi ricombinanti

più semplici da ottenere con un incrocio tra soggetti della progenie di un fondatore transgenico controllato


Ciambelle senza il buco

Ciambelle senza il buco

Quando non si vede l’organismo transgenico

Gene dominante letale

Assenza di fenotipo con l’eterozigote

Necessità dell’omozigote

L’omozigote solo per incrocio mai su tentativo con blastocisti dell’eterozigote,

La probabilità di un secondo evento omologo è assolutamente improponibile


Necessit di una strategia alternativa

Necessità di una strategia alternativa

Riuscire ad avere mutanti condizionali:

Nel momento giusto e nel tessuto giusto

Un sistema con controllo spazio - temporale

Esiste?

Benemerito chi l’ha inventato

Applicazione da un sistema procariotico del fago P1


A cosa serve come si applica

A cosa serve come si applica

Da un sistema procariotico ad uno eucariotico

Attuare o far avvenire la ricombinazione al momento voluto

Ricombinazione: applicazione più usata per fare delezioni

Si può anche fare inversione, integrazione o scambio

Il metodo deriva dal meccanismo di azione dell’enzima CRE

(enzima che crea ricombinazione)

Come avviene la ricombinazione, è l’enzima che è specifico

e che riconosce la sequenza lox su cui inerviene


Ricombinazione tramite siti specifici lox p

Ricombinazione tramite siti specifici Lox P


Cre lox sito specifica

Cre-lox sito specifica

Modello di taglio e giunzione dei due filamenti di DNA di un sito lox P


Swapping model

Swapping model

Modello di scambio


Modello di ricombinazione

Modello di ricombinazione

Intermedio cruciforme

isomerizzazione


Intermedi

intermedi

(A) Schematic drawing of the Cre−loxP site-specific recombination pathway, based on the strand-swapping model (Nunes-Düby et al., 1995) and on Cre−loxP structural models (Guo et al., 1997; this work). Conserved tyrosine residues from two of the four recombinases in a synaptic tetramer cleave the DNA backbones of the recombining segments to form transient 3'-phosphotyrosine linkages. The released 5'-hydroxyl ends of the cleaved DNA undergo intermolecular nucleophilic attack of the partner phosphotyrosine linkages to complete the exchange of one pair of strands and form a Holliday intermediate. A second round of cleavages and strand exchanges using the remaining two recombinase subunits and the complementary DNA strands gives recombinant products. (B) Sequences of loxP and loxS6 DNA duplexes used to design the HJs HJ1 and HJ2. HJ1 and HJ2 are shown in the same orientation as in Figure 3. For HJ1, the strand-bridging arms I and II contain the wild-type loxP sequence and the strand-bridging arms III and IV contain the loxP complementary sequence. Bases that are not related by twofold symmetry and prevent branch migration are highlighted in yellow. Vertical lines indicate missing phosphates in the DNA backbone. The 13 bp inverted repeat binding sites for Cre recombinase are underlined and the 6 bp crossover region between cleavage sites are in bold. For both the Cre−HJ1 and Cre−HJ2 complexes, an additional 5'-overhanging thymidine residue was found to facilitate crystallization.


Modello cre lox

Modello cre-lox

Struttura cruciforme di Holliday


Ricombinase

ricombinase

Cre =

Creating

Recombination

enzyme


Lox taglio e riunione

Lox taglio e riunione


Modello cruciforme

Modello cruciforme


Modello interazione cre

Modello interazione CRE


Ricombinazione tramite cre lox

Ricombinazione tramite Cre Lox

a

b

c

intramolecular deletion

inversion

a

b

c

tandem

palindrome

a

c

a

d

c

b

a

b

c

scambio su cromat. fratelli

a

c

a

c

b

a

b

c

a

c

b

intramolecular deletion / duplication

integration


Come funziona cre lox

Come funziona Cre-Lox

inversion

intramolecular deletion

a

b

c

a

b

c

a

c

a

d

c

b

a

b

c

a

c

a

c

a

c

b

a

b

c

b

intramolecular deletion / duplication

integration

Lox site


Mutanti condizionali

Mutanti condizionali

Sfruttando il sistema di ricombinazione del fago P1 con i siti Lox e la ricombinasi Cre, si possono ottenere dei mutanti che perdono la regione voluta solo attivando la ricombinasi Cre.

Si devono costruire dei vettori con siti Lox (di solito in due introni diversi) all’esterno del gene da eliminare, oppure della regione da eliminare. Si chiamano floxed gli esoni o le regioni da excidere.

Si rende attivo per interference un vettore con tandem che diventa plindrome per inversione Cre-Lox.

Con questa strategia si possono ottenere cellule o topi transgenici per geni che sono letali in fasi diverse e soprattutto con l’espressione della ricombinasi Cre tessuto specifica, si può far avvenire il knock-out del gene solo in particolari tessuti dove si esprime o dove si induce Cre.

Il sistema cre-lox


Il costrutto per il gene floxed

Il costrutto per il gene floxed

ricombinaz.

omologa

esone x

esone y

esone z

gene tk

introne x

costrutto

loxP

loxP - neo - loxP

esone z

esone x

esone y

introne x

costrutto

ricomb.

gene tk

loxP - neo - loxP

loxP

induz. di Cre

neo

esone x

esone y

esone z

introne x

ricombinaz.

e delez. neo

gene tk

loxP loxP

Il gene per la timidino kinasi del virus Herpes simplex rende le cellule

sensibili al Ganciclovir

Nel caso di ricombinazione non omologa il gene tk non verra’ eliminato e le cellule potranno essere eliminate con la selezione dell’antibiotico

Dopo l’eliminazione della resistenza alla neomicina per l’induzione del gene Cre le cellule ES mutanti sono pronte per essere iniettate nelle blasocisti (si possono usare cellule con doppia resistenza)


Topi transgenici mutanti condizionali

Topi transgenici mutanti condizionali

Il limite principale dei topi transgenici knock-out per un gene e’la possibile mortalita’ degli omozigoti durante lo sviluppo.

- una soluzione per questo problema potrebbe essere l’induzione della mutazione tempo e tessuto specifica

- e’ stato applicato il sistema di ricombinazione fagica (fago P1) Cre-Lox utilizzato anche in biologia cellulare perche’ inducibile

- Cre e’ la ricombinasi (causa ricombinazione) e LoxP (locus di crossover in P1), serve per mantenere una sola copia del genoma, evita i multimeri

- i siti Lox sono costituiti da palindrome di 13 bp ed una regione centrale di 8bp

- la ricombinasi fa avvenire lo scambio di filamento tra due strutture Lox allineate originando delezione se sono in tandem, inversione se sono in palindrome, duplicazione se sono su cromatidi fratelli e integrazione se c’e’ un elemento in un plasmide ed un altro nella sequenza dove si integra (vedi fig. 1)


Applicazioni del metodo cre lox

Applicazioni del metodo Cre-Lox

- Questa tecnologia e’ applicata alle cellule staminali di topo ES.

- L’inserzione dei siti LoxP si deve far avvenire tramite gene-targeting con un costrutto specifico (i costrutti con i geni con le regioni fiancheggianti che contengono siti LoxP si chiamano “floxed”)

- quando si esprime il gene Cre avviene la ricombinazione e se si esprime solo in un tessuto la mutazione diventa tessuto specifica e si puo’ seguire il destino delle cellule che lo vanno a formare, per esempio nelle cellule pancreatiche quelle che formeranno le cell. a e b

-l’espressione del gene Cre non sempre e’ omogenea nel tessuto e la ricombinazione avviene a mosaico non nel 100% delle cellule

- come controllo si usano due geni reporter, per cui se si ha ricombinazione il primo fiancheggiato da due siti Lox (lacZ) si inattiva e si attiva il secondo gene reporter (di solito la GFP o la fosfatasi alcalina)

L’introduzione delle cassette per la resistenza ed i siti LoxP si fa avvenire per ricombinazione omologa


Condizioni di funzionamento

Condizioni di funzionamento

Il gene per la ricombinasi Cre deve essere indotto e deve esprimersi al

momento giusto e nel posto giusto

Ci sono linee di topi transgenici che esprimono Cre nelle cellule epatiche, oppure nel sistema nervoso centrale SNC o altri sistemi

Sono state fatte proteine di fusione con il dominio mutato di legame al ligando (ligand binding domain LBD) dell’ormone degli estrogeni, in modo che la ricombinasi sia confinata nel citoplasma finche’ non viene somministrato l’ormone sintetico che riconosce il recettore e fa traslocare la proteina di fusione con la ricombinasi nel nucleo dove induce la delezione del frammento incluso tra i due siti LoxP

(vedi esempio della figura precedente)


Cre lox

CRE LOX

  • Analisi del sistema CRE-LOX per topi transgenici con “Gene Targeting” sito e tempo specifici.

  • (Methods 24 , 2001, pag 71-80) D.Metzger e P.Chambon

  • - limitazioni del Gene targeting : l’assenza della funzione colpita (targetet) da mutazione durante le fasi di sviluppo puo’ risultare letale precludendo lo studio di funzioni possibili negli stadi iniziali e successivi a quello letale.

  • - molti geni svolgono funzioni multiple in vari tipi di cellule durante l’ontogenesi e fase postnatale (pleiotropici), questo provoca fenotipi complessi e complica l’individuazione di cellule anomale prodotte da fenomeni con piu’ cause.

  • l’effetto di una mutazione puo’ essere compensata durante lo sviluppo manca il fenotipo alterato nell’animale adulto.

  • Per famiglie di geni si devono mutare piu’ geni della stessa famiglia per prevenire la ridondanza funzionale di espressione che preclude l’identificazione di una funzione di un componente della famiglia genica.


Geni pleiotropici

Geni pleiotropici

- Definire una funzione di un gene membro di una famiglia puo’ essere ancora piu’ complicato quando la famiglia e’ coinvolta in un sistema pleiotropico di un pathway di segnali come i recettori per l’acido retinoico o FGF.

- Altri effetti confondenti il knock-out di un gene possono essere il rischio di danno sulla fertilita’e disordini sistemici.

- In tutti questi casi sara’ problematico determinare la funzione di un gene in una frazione di cellule ad un certo momento della vita del topo.

- inoltre nel caso di modelli animali di patologie umane con mutazioni somatiche come il cancro

- Quindi la necessita’ di avere un metodo con l’inattivazione condizionale di un gene e’ molto forte

Sono state sviluppate strategie per avere gene-targeting condizionale in topo basato su cellule tessuto-specifico o espressione inducibile sito specifica del gene della ricombinasi CRE del fago P1.


Cre lox ed rna interference condizionale

CRE-LOXed RNA interference condizionale

Metodi per interferire con l’espressione di un gene: “stable suppression of gene expression by RNAi in mammalian cells” P.N.A.S. vol.99 n.3 pp 1443-8 P.J.Paddison et al.

- mutagenesi, mutazioni termo sensibili(condizionali), soppressori

- knock out per ricombinazione

- anticorpi contro la proteina (prodotti da un vettore)

- RNA antisenso trascritto da un vettore

- oligo antisenso

Questi metodi hanno il difetto di non essere sempre applicabili ai sitemi eucarioti; in certi casi non sono regolabili. L’RNA antisenso per funzionare deve essere aggiunto in dosi massicce, oppure deve essere trascritto dentro la cellula, ma il funzionamento della interferenza e’ legata al sistema Dicer, cioe’ ad un pathway enzimatico che riduce l’RNA specifico del messaggero in frammenti.

E’ stato fatto un esperimento sfruttando il metodo CRE Lox per produrre un RNA a doppio filamento per bloccare l’enzima Dicer stesso


Soppressione stabile dell espressione genica tramite rna interference in cellule di mammifero

Soppressione stabile dell’espressione genica tramite RNA interference in cellule di mammifero

L

L

r

r

ZEO

ZEO

GFP

GFP

Gene per la resistenza alla zeocina;

Lox P;

L

Promotore di citomegalovirus;

P

Le prime 500 bp codificanti di enhanced gr. fluor. prot. EGFP;

GFP

Sistema cellulare di difesa antivirale

Blocco non specifico della traduzione

dimerizzazione

fosforilazione

PKR (kinasi)

EIF2

dsRNA esogeno

(~ 500 bp)

Cofattore per la ribonucleasi non - specifica (Rnasi L)

2’- 5’ oligodenilato polimerasi

attiva

pcDNA3

P


Modello per interferenze con cre lox

Modello per interferenze con Cre-Lox

r

r

r

ZEO

ZEO

ZEO

GFP

GFP

GFP

L

L

P

L

Ricombinasi CRE

P

GFP

L

dsGFP


Espressione di cre

Espressione di CRE

Rapporto FF:REN

Riduzione di 10 volte dell’espressione di FF in cellule trasfettate con i due plasmidi FF/REN

ds = double strand

ss = single strand

as = antisense

FF = firefly luciferase REN = renilla luciferase


Approccio olistico globale allo studio della biologia

Approccio olistico globale allo studio della biologia

Sviluppo del metodo riduzionistico incapace di sviluppare lo studio delle interazioni multiple tra le funzioni cellulari


Nuove tecniche nuovi vettori

nuove tecniche nuovi vettori

  • Dall’inizio dei progetti di sequenziamento dei Genomi di organismi eucariotici e’ iniziato un nuovo tipo di approccio per lo studio delle funzioni ed interazioni dei geni.

  • Abbiamo visto nel modello murino

  • - la possibilità di studio di funzione dei geni durante lo sviluppo con il metodo di knock-out con la ricombinazione omologa.

  • - la possibilita’ di studiare le interazioni a livello di famiglie di geni.

  • i nuovi metodi per lo studio di interazioni tra proteine con geni reporter e geni regolatori della trascrizione.

  • metodi per individuare proteine che legano altre proteine col metodo del doppio ibrido (variante della complementazione con un gene reporter)


Sistemi multifattoriali

Sistemi multifattoriali

E’ sempre più necessario poter studiare la funzione di gruppi di geni per le molte funzioni ed interazioni che esistono, per cui ogni gene può intervenire in molte funzioni indipendenti ed il cnock-out di un singolo gene può provocare una cascata di eventi, quello che poteva essere definito come l’assenza di un unico fenotipo.

In patologia una sindrome è data da un insieme di sintomi che possono essere appunto spiegati con le molte interazioni ed i molti effetti che può provocare la disregolazione di un gene.

Andate a rivedere cosa sono gli effetti di EPISTASI E PLEIOTROPIA


Ricerca di geni nuovi tramite mrna di fusione

Ricerca di geni nuovi tramite mRNA di fusione

Quindi sono stati sviluppati due approcci nuovi per la ricerca di nuovi fenotipi ed espressione di molti geni :

la conoscenza delle sequenze di molti geni coinvolti nel controllo di funzioni complesse come quelle che regolano la divisione cellulare, la morte cellulare e le corrispondenti vie di trasduzione dei segnali con le regolazioni fini ed i processi di stimolazione o inibizione hanno aperto la necessità di studiare molti geni coinvolti e la variazione di espressione.

Un metodo per cercare geni nuovi in vivo non era stato ancora inventato

L’approccio completamente nuovo e’ stato quello del “gene trapping” (l’acchiappa geni) per poter individuare molti geni contemporaneamente.

Per poter studiare contemporaneamente l’espressione di molti geni è stato inventato il metodo dei macro e micro arrays.


Gene trapping l acchiappa geni

Gene trapping “l’acchiappa geni”

Idea luminosa sempre per fare topi transgenici:

Creare un vettore per integrazione random che possa esprimere la resistenza solo se genera un mRNA di fusione

Premessa: non è detto che dalla conoscenza della intera sequenza genomica si possa dedurre in maniera completa quali siano tutti i geni attivi e anche tutti gli eventuali splicing alternativi a carico dei geni ed in tutti i tessuti

Come deve essere fatto un vettore del genere?


Lezione 19 20 marted 3 maggio 2011

Tutte queste tecniche sono state sviluppate a partire dall’idea di vedere in maniera olistica, cioe’ con un approccio globale come i geni interagivano nel complicato network cellulare.

Le interazioni cellulari ed intercellulari hanno la possibilita’ di essere studiate non piu’ con un approccio semplice di inerazione un gene una proteina ed una funzione, ma molti geni con le loro interazioni mediate dagli enzimi a tutti i livelli a partire dalla trascrizione, dalle interazioni a livello nucleare, citoplasmatico di membrana, di trasporto e di secrezione e quindi le interazione con altre cellule.

I macro e poi micro-arrays mettono a disposizione su supporti di vario tipo centinaia di geni selezionati e a volte in toto per vederne l’espressione.

Nel caso di patologie in cui non sono ancora conosciute le cause dell’attivita’ degenerativa di geni coinvolti, si possono vedere le differenze tra l’espressione dei geni in condizioni normali e patologiche e quindi i geni che sono attivati o spenti per il cattivo funzionamento del gene/geni scatenanti la patologia.


Lezione 19 20 marted 3 maggio 2011

Per esempio nel caso delle neoplasie i fattori coinvolti partecipano al controllo della vita cellulare nei vari punti di vitali/essenziali del controllo delle attivita’ cellulari.

L’approccio globale puo’ far vedere i geni a monte ed a valle coinvolti ed il punto di mancato funzionamento all’interno della complessa macchina.

Nel sistema immunitario in cui si conoscono decine di fattori come le interleukine / chemochine con i rispettivi recettori cellulari si possono vedere a livello di patologie le reti interattive che ancora non erano state descritte.

La possibilita’ di vedere la funzione di nuovi geni che ancora non sono stati descritti per la precisa attivita’ può essere data dalla conoscenza a livello di genoma della struttura a cui adesso si puo’ attribuire una funzione generalmente per omologia con altre strutture note.


Lezione 19 20 marted 3 maggio 2011

Lettura e commento del paper di Nature 1998 vol 392 / 9Aprile pp 608-611: Disruption and sequence identification of 2,000 genes in mouse embrionic stem cells (ES). Brian P. Zambrowicz et al.

Gene trapping : metodo di mutagenesi per inserzione random con vettori per geni reporter o selezionabili.

-l’inserzione genera la marcatura (tags) di geni successivamente clonabili,

-espressione solo se l’inserzione avviene in introni; mi permette di individuare esoni o promotori di geni attivi e non restringendo/selezionando il tipo di geni marcabili

-finqui’ non esisteva automazione per l’identificazione dei geni bersaglio che possono non essere trascritti e se ne può individuare anche la regione 5’non tradotta,

Per ottenere questi obbiettivi sono stati sviluppati due nuovi vettori per GeneTrapping:VICTR3 e VICTR20


Gene trapping metodo basato sull uso di cellule staminali

Gene trapping = metodo basato sull’uso di cellule staminali

La prima utilizzazione è stata quella della ricombinazione omologa con cnock-out di un gene.

Il “genetrapping” è un nuovo metodo che permette il cnock-out di geni che si esprimimono o no in “embrional stem cells” ES utilizzate per ottenere topi transgenici.

Le cellule embrionali staminali totipotenti di topo dal momento in cui sono state coltivabili sono state usate per ottenere topi transgenici


Lavoro victr 3 e victr 20 gene trap

Lavoro Victr 3 e Victr 20 gene trap

Lettura e commento del paper di Nature 1998 vol 392 / 9Aprile pp 608-611: Disruption and sequence identification of 2,000 genes in mouse embrionic stem cells (ES). Brian P. Zambrowicz et al.

Gene trapping : metodo di mutagenesi per inserzione random con vettori per geni reporter o selezionabili.

-l’inserzione genera la marcatura (tags) di geni successivam. clonabili

-espressione solo se l’inserzione avviene in introni, esoni o promotori di geni attivi restringendo il tipo di geni marcabili

-finqui’ non esiste automazione per l’identificazione dei geni bersaglio che possono non essere trascritti o corrispondono alla regione 5’non tradotta,

Per superare questi limiti sono stati sviluppati due nuovi vettori per GeneTrapping: VICTR3 e VICTR20


Victr3 victr20

VICTR3 VICTR20

Quali sono i costituenti di questi vettori:

2 componenti : a) acquisizione di sequenza con il promotore della PGK (fofsfo glicerokinase) di topo attiva nelle cellule ES, fuso alla Puromicina N-acetiltransferase senza polyA ma con un sito SD (splice donor)

b) SA (splice acceptor) fuso ad un marker selettivo e reporter (colorimetrico) con sito polyA (SAgeobpA o SAIRESgeobpA gene di fusione   neomicina)

Questi costrutti non hanno bisogno di inserirsi in geni attivi per essere marcati (trapped) e la sequenza si individua tramite RACE 3’ del cDNA di fusione e ricerca in banca dati del gene.


Controllo hprt

Esperimento di controllo sulla funzionalità di questo tipo di vettori

-Prova di efficienza del vettore PGKpuroSD (fosfoglicero Kin., puromicina, splice donor site) per cercare un gene target per eccellenza: il gene della Hgprt = Hprt (ipoxantina-guanina fosforibosiltransferase per ricombinazione omologa nell’ introne II. (I geni Hprt e tk timidino-kinasi mutati danno la sensibilita’ al terreno HAT hypoxanthine, aminopterin and thymidine e solo Hprt produce resistenza alla 6-thioguanina).

Le sequenze della 3’RACE di colonie Purom. res. hanno confermato l’integrazione nel sito corretto confermando la capacita’ mutagenica del costrutto.

L’integrazione del vettore al 3’ del gene HPRT produce cellule sensibili al terreno HAT e resistenza alla 6-thioguanina dando il gene di fusione con il 3’ ed utilizzando il sito poly A+ del gene endogeno HPRT.

Controllo HPRT


Gene trapping tramite victr 3 e 20

Gene trapping tramite Victr 3 e 20

vettori per il 3’o 5’ “trapping”(presenza di LTR virali per l’integrazione nel genoma ospite)

LTR

PGK

puro

SD

LTR

VICTR3

VICTR20

LTR

SA

IRES geo

pA

PGK

puro

SD

LTR

Wild-type locus

LTR

SA

IRES geo

pA

PGK

puro

SD

LTR

G

G

AAAAAn

AAAAAn


Lezione 19 20 marted 3 maggio 2011

HindIII

LTR

LTR

targeting vector

probe

WT HPRT

3

2

H

4

H

7.1 kb

targetet allele

Southern blot Hind digest

LTR

2

3

4

H

LTR

H

9.2 kb

Mappa del vettore VICTR20 per ricombinazione nel gene Hprt

clonato nel vettore pRIV6.9I nel sito EcoRI

wt

wt

6TG

6TG


Lezione 19 20 marted 3 maggio 2011

Studi preliminari hanno mostrato che vettori con il modulo SAbgeobpA sono in grado di creare alleli “nulli” inattivando i messaggi endogeni.

In questo esperimento sono stati provati VICTR20 e PGKpuroSD per mutagenizzare il gene HPRT selezionando per la 6-thioguanina resist.

Il vettorePGKpuroSD non ha dato colonie resistenti (controllo con Southern)

Nuovo esperimento di controllo con elettroporazione del plasmide PGKpuroSD o infettando le cellule staminali ES con il retrovirus prodotto con la linea cellulare ricombinante di MoMLV per impacchettare VICTR3 e VICTR20.

- trasduzione - selezioni di cloni puromicina +

- isolamneto dell’ RNA e 3’RACE - sequenziamento 80-700 bp dal 75% dei cloni analizzati manualmente e 60% dall’analisi (automatizzata) robotica

- creazione della banca dati con questi cloni = Omnibank seq. tags OST

-confronto con la GeneBank (versione 100) e SwissProt (vers.34) con Blast

RISULTATI = P<10-30; 18% geni noti; 10% ESTs umani e roditori; 10% ripetiz. B1, B2 e trasposoni; 61% sequenze sconosciute


Lezione 19 20 marted 3 maggio 2011

Controllo per dimostrare l’efficienza dei cloni OSTs a

individuare il gene raggiunto ed il sito di integrazione del retrovirus

- analisi Southern per individuare l’inserzione nel gene tirosin-kinasi di Bruton (btk locus) la sequenza cominciava con l’esone 2 indicando l’inserzione del vettore nel 1 introne di btk.

- analisi con 3 enzimi di restrizione ha confermato questa ipotesi (fig 3)

Controllo dei siti di integrazione

- confronto della seq. cDNA dei cloni OSTs con 108 geni noti: 44% inseriti nelle 350 basi al 5’ dei geni; 12% al 3’ di cDNA codificanti. Benche’ il vettore potrebbe favorire regioni 5’ ma integra ovunque.

Il vettore dovrebbe integrare in tutti i geni e non solo in quelli espressi in cellule ES, infatti il gene btk si esprime nei linfociti B. Per RT-PCR si trova in cellule della milza, ma non in cellule ES.

- sequenziamento di 3000 OSTs ha dimostrato che solo il 10% contiene il vettore dopo il sito SD esogeno. 61% degli OSTs sta in geni trascritti.

- analisi di espressione per RT-PCR di 37 OSTs (17 elettropor. 20 infez.)

34 sono espressi in cervello, testicoli, ES o embrione 10.5 g


Costrutti victr3 victr20

Costrutti VICTR3 VICTR20

2 componenti : - a) acquisizione di sequenza con promotore della PGK (fofsfo glicerokinase) di topo attiva nelle cellule ES fuso alla Puromicina N-acetiltransferase senza polyA ma con un sito SD (splice donor)

- b) SA (splice acceptor) fuso ad un marker selettivo e reporter (colorimetrico) con sito polyA (SAbgeobpA o SAIRESbgeobpA)

Questi costrutti non hanno bisogno di inserirsi in geni attivi per essere marcati (trapped) e la sequenza si individua tramite RACE 3’ del cDNA di fusione e ricerca in banca dati del gene.

-Prova di efficienza del vettore PGKpuroSD ricercando il gene della Hgprt = Hprt (ipoxantina-guanina fosforibosiltransferase per ricombinazione omologa nell’ introne II. (I geni Hprt e tk timidino-kinasi mutati danno la sensibilita’ al terreno HAT hypoxanthine, aminopterin and thymidine e solo Hprt resistenza alla 6-thioguanina). La sequenza della 3’RACE di colonie Purom. res. hanno confermato l’integrazione nel sito corretto confermando la capacita’ mutagenica del costrutto.


Race per gene trapping

Race per gene trapping

VICTR-3 è costruito per funzionare con l’integrazione all’interno geni attivi e non attivi.

Per individuare il gene di fusione che si ottiene si deve fare RACE 3’ ed eventualmente gene walking al 5’ dopo aver individuato la regione.

gene trapping di VICTR-3/VICTR-20


Lezione 19 20 marted 3 maggio 2011

Ulteriore dimostrazione che i cloni OSTs corrispondono a sequenze esoniche e non a RNA nucleari non maturi sono stati fatti i Northern di poly A+ RNA di molti tessuti e ibridati con 16 probes OSTs sconosciuti dando 14 segnali positivi confermando la presenza di questi geni.

Siccome i prodotti di 3’ RACE tendono ad essere piu’ lunghi degli OST iniziali, e’ stato fatto il sequenziamento aggiuntivo di 290 OSTs con 70-700 bp in aggiunta per media di 263 bp.

- la nuova analisi Blast sulla GenBank mostra 27% di geni noti (43 noti e 34 ESTs) questo rinforza il fatto che i vettori si inseriscono in sequenze trascritte. Le sequenze OST hanno media di 500bp con 74% geni ignoti

Un limite di questo metodo come della selezione di cloni EST e’ la sottorappresentazione dei geni poco espressi o transienti in tessuti limitati.

Comunque i metodi di “gene trap” non sono senza pressioni selettive per il disegno, veicolazione, grandezza del bersaglio e accessibilita’ del gene, però i risultati dimostrano un largo spettro di eventi indipendenti.

Adesso si può sapere la sequenza di ingresso del vettore ed il gene mutato da cui ottenere il topo transgenico.


Costrutti per gene trapping

ei

ee

pA

 geo

 geo

 geo

U3 RU5

Sup 5

U3 RU5

sa Lac Z

P-neo

PT1  geo lacz neo

costrutti per gene trapping

  • ei engrailed 2 intron; ee eng 2 exon

  • geo = lac z - neo fusion

    pA poly adenilation signal

U3  geo

U3 LTR region enhancerless Mol mur Leuk

Sup 5 E. coli sup F tRNA

RU5 Mason-Pfizer monkey virus translational enhancer

TS4


Topi transgenici di iii e iv generazione

Topi transgenici di III e IV generazione

I- iniezione DNA blastocisti

II- embrional staminal cells e ricomb. omologa

III- mutanti condizionali Cre-Lox e promot. tessuto specif. e inducibili

IV- costrutti con cromosomi artificiali BAC, embrioni tertraploidi

V- gene trapping libraries of ES cells

combinazioni di vettori BAC floxed knock-in


Race per gene trapping1

Race per gene trapping

VICTR-3 è costruito per funzionare con l’integrazione all’interno geni attivi e non attivi.

Per individuare il gene di fusione che si ottiene si deve fare RACE 3’ ed eventualmente gene walking al 5’ dopo aver individuato la regione.

gene trapping di VICTR-3/VICTR-20


Topi transgenici che esprimono cre

Topi transgenici che esprimono Cre

Enhancer tessuto specifico del gene di topo mDach I (D6)

il promotore è attivato al giorno 10.5 (post coitum)

Il topo D6Cre incrociato con il topo Gtrosa (B6.129S7) gal si colora in blu perché libera l’espressione eliminando un gene floxed interposto tra il promotore e LacZ.

Controllo dell’espressione di Cre tramite promotore tessuto specifico


Lezione 19 20 marted 3 maggio 2011

http://www.mshri.on.ca/nagy/Cre-pub.html

  • http://authors.elsevier.com.

Ceppi di topo che esprimono il gene Cre in tessuti diversi


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