Speciální světelná, fluorescenční a konfokální mikroskopie

1. Speciální světelná, fluorescenční a konfokální mikroskopie

2. Dozvíte se něco o: Speciální světelné mikroskopii • Zástin a fázový kontrast • Nomarského diferenciální interferenční kontrast (DIC) • Hoffmanův modulační kontrast • Fluorescenční mikroskopie • Konfokální mikroskopie Vyzkoušíte si přípravu preparátů

3. Datum Mikroskopická technika - Blok 2 Vzor protokolu Úloha 1 – Autofluorescenceplastidu Organismus Zvětšení Nativní preparát Krátký komentář…….. Protokoly budou obsahovat výsledky tří úloh, které si společně provedeme. Fotografie preparátů umístíme po praktiku na web a pošleme Vám odkaz. Obrázky vytisknete barevně nebo černobíle a dokreslíte pastelkami nebo fixy. Opatříte je popisky a krátkým komentářem. Foto Úloha 2 – Značení mitochondrie Organismus Zvětšení Nativní preparát Krátký komentář…….. Foto Úloha 3 – Imunofluorescence Organismus Zvětšení Trvalý preparát Krátký komentář…….. Foto Foto Foto Foto

4. Skládání a ohyb světla

5. Skládání a ohyb světla

6. Typy preparátů • Amplitudové = zbarvené objekty absorbující světlo - rovnoměrně, jeví se jako tmavé - různě, jeví se jako barevné • Fázové = nebarevné objekty, lišící se indexem lomu a tloušťkou Jejich kontrast lze zvýšit - barvením preparátů - optickými metodami

7. Preparát č. 2:Entamoeba invadens (fázový kontrast)

8. 1 Koehlerovo osvětlení (ideální nastavení světla v mikroskopu) 2 • V dráze světelných paprsků v mikroskopu existuje několik rovin, které si jsou vzájemně zaostřené (skrze čočky) - konjugované. • Pokud pozorujeme objekt v preparátu, tak k naší sítnici (1) je konjugovaná obrazová rovina objektivu (2), rovina preparátu (3). Aby byl preparát ideálně osvětlen, je potřeba, aby s těmito rovinami byla konjugovaná rovina povrchu zdroje světla (4). • Nastavení se provádí posunem kondenzoru nahoru a dolů. Zároveň je potřeba světlo vycentrovat. • Při takovém nastavení obraz neovlivňuje vlákno žárovky (nerovnoměrný zdroj světla), ale promítá se do něj povrch zdroje světla, ze kterého vychází rovnoměrné odvětlení. Preparát je tak rovnoměrně osvětlen. 3 Povrch zdroje světla 4

9. Nastavení Koehlerova osvětlení 1 2 2 1 3 http://www.youtube.com/watch?feature=player_detailpage&v=fNTNZ8nWPd4

10. Metody zvýšení kontrastu Zástin: clona zachycuje paprsky procházející přímo do objektivu, preparát je osvětlen z boku

11. Metody zvýšení kontrastu Fázový kontrast: rozdíly v posunu fáze světla, které neumíme vnímat, převádí na rozdíly v jeho intenzitě

12. Fázový kontrast

13. Preparát č. 2:Entamoeba invadens (fázový kontrast)

14. Preparát č. 1:Tritrichomonas foetus (fázový kontrast)

15. Nomarského diferenciální interferenční kontrast (DIC): zobrazuje optický reliéf, který je u biologických objektů zpravidla shodný s reálným prostorovým reliéfem

16. Metody zvýšení kontrastu Hoffmanův modulační kontrast (HMC):podobný výsledek jako DIC, levnější, nevyžaduje polarizované světlo – proto jím lze pozorovat i objekty na dvojlomných podložkách (plastikové misky)

17. Preparát č. 4:Trypanoplasma borreli (DIC)

18. DIC (Nomarského kontrast)

19. Imunofluorescenční barvení Giardiaintestinalis • Odkápnout blokovací roztok a přidat 500 µl roztoku s protilátkami. • Inkubovat ve vlhké komůrce30’

20. Luminiscence Chemiluminiscence luciferáza – luciferin Excitace zářením: fosforescence fluorescence

21. Fluorochromy Přirozená luminisence chlorofyl

22. Fluorochromy Přirozená luminisence chlorofyl Přímá vazba fluorochromu DAPI, ethidiumBr, propidium jodid

23. Fluorochromy Přirozená luminisence chlorofyl Přímá vazba fluorochromu DAPI, ethidiumBr, propidium jodid Nepřímá vazba fluorochromu pacific blue, alexa fluor 488, FITC, TRITC, alexa fluor 635

24. Imunofluorescence F F F F F F vazba sekundární protilátky s konjugovaným fluorochromem (FITC apod.) vazba primární protilátky s konjugovaným fluorochromem (FITC apod.) vazba primární protilátky

25. Imunofluorescence F F F F F F

26. Imunofluorescence F F F F F F HA (hemaglutinin tag): YPYDVPDYA HA HA HA

27. Imunofluorescenční barvení Giardiaintestinalis • Odkápnout blokovací roztok a přidat 500 μl roztoku s protilátkami. • Inkubovat ve vlhké komůrce30’

28. Imunofluorescence HA (hemaglutinin tag): YPYDVPDYA HA HA HA IscU (mitochondriální protein) α-tubulin

29. Fluorochromy Vložení genu pro fluorochrom přímo do genomu GFP, RFP, YFP, CFP

30. Mitotracker

31. Mitotracker Naegleriagruberi • Do kultury přidat 1 μl mitotrackeru. • Inkubovat při pokojové teplotě 30’ i více.

32. Filtry: excitační a bariérový

33. Filtry: excitační a bariérový

34. Filtry:excitačnía bariérový&dichroické zrcátko

35. Filtry:excitační a bariérový&dichroické zrcátko

36. Fluorescenční mikroskop

37. Co znamená „konfokální“?

38. Obraz je rekonstruován počítačem Zdrojem světla je laserový paprsek Je snímán jen obraz ze zaostřené roviny preparátu Konfokální mikroskop

39. Využití fluorescenční a konfokální mikroskopie imunologie – lokalizace epitopů FITC, DAPI…

40. Imunolokalizace

41. Imunolokalizace

42. Imunolokalizace

43. FISH Fluorescence In Situ Hybridization

44. Využití fluorescenční a konfokální mikroskopie Imunologie: lokalizace epitopů FITC, DAPI… Genomika: exprese a funkce genů GFP, RFP, YFP, CFP

45. Využití GFP

46. Využití fluorescenční a konfokální mikroskopie Imunologie: lokalizace epitopů FITC, DAPI… Genomika: exprese a funkce genů GFP, RFP, YFP, CFP Proteomika: sledování pohybů a interakcí proteinů in situ PA-GFP, FRAP,FRET

47. Exkurze do laboratoře konfokální mikroskopie

48. Autofluorescence plastidů Zygnemasp. Euglenagracilis • Kápneme na sklíčko a pozorujeme 1000x zvětšeno s immerzním olejem. Plastidy emitují červené světlo.

49. Mitotracker Naegleriagruberi • Kápneme na sklíčko a pozorujeme 1000x zvětšeno s imerzním olejem. Mitotracker emituje červené světlo.

50. Imunofluorescenční barvení Giardiaintestinalis HA HA HA IscU (mitochondriální protein) α-tubulin