RNA- Seq : Conceito e Aplicações

1. Disciplina BMP 5762 – BioinformáticaAplicadaaoEstudo de DoençasParasitárias RNA-Seq: Conceito e Aplicações Ana da Rocha Kurata Katie Cristina Takeuti Riciluca

2. RNA-seq • RNA-seq é uma abordagem recentemente desenvolvida, para analisar o perfil de transcriptoma, que utiliza tecnologias de deep-sequencing. • O transcriptoma é o conjunto completo de transcritos (RNAs) em uma célula, e sua quantidade, para um estágio de desenvolvimento específico ou condição fisiológica. • * deep-sequencing = indica que a cobertura do processo é muito maior que o comprimento da sequencia em estudo.

3. O entendimento do transcriptoma é essencial para: • Interpretar os elementos funcionais do genoma • Revelar os constituintes moleculares de células e tecidos nos diferentes estágios de desenvolvimento • Compreender os elementos presentes no desenvolvimento de doenças • O transcriptoma pretende catalogar todos os tipos de transcritos: • mRNAs • RNAs não codificadores • pequenos RNAs.

4. Porquêestudar o transcriptoma? • Para determinar a estruturatranscripcional dos genes, emtermos de seussítios de início 5’ e final 3’; • Padrões de splicing e outrasmodificaçõespós-traducionais; • Quantificarosníveis de mudanças de expressão de cadatranscritodurante o desenvolvimento e sob condiçõesdiferentes. • Encontrar microRNAs quepossuemfunçãoreguladora • Metagenômica * Splicing = é um processo que remove os íntrons e junta oséxons depois da transcrição do RNA. O splicing só ocorre em células eucarióticas, já que o DNA das células eucarióticas não possui íntrons.

5. Criação da Biblioteca • Pode-se utilizar: • Todo o RNA da célula • Possui 90-95% de rRNA • Apenas mRNA selecionadopelacauda de poli-A • Perde-se microRNAs e mRNAs sempoli-A • Retirando o rRNA • Porhibridização comsequencias específicas ligadas a biotina que são retiradas com esferas ligadas a streptovidina • Quebra por uma exonucleaseque age sobre RNAs que possuem fosfato na extremidade 5' (apenas rRNAs possuem esse fosfato) • A remoção de rRNAsaumentaa detecção e a montagem de transcritosraros. • Mas se o objetivo do estudo é a quantificação, é necessárioumabibliotecanãodepletada.

6. Criação da Biblioteca • Para a criação da biblioteca o RNA é transformado em cDNA por uma transcriptase reversa • Para não se perder a direcionalidade do transcrito podem ser acrescentados adaptadores a uma extremidade do RNA • isso é muito importante no estudo de espécies de genoma muito compactado onde o transcrito pode se sobrepor em fitas opostas • O RNA pode ser fragmentado antes da formação de cDNA evitando a formação de estrutura secundária

8. Cada molécula de cDNA, com ou sem amplificação, é então sequenciada com um método de alto rendimento para obter sequências curtas de um final (sequenciamento single-end) ou de ambos os lados (sequenciamento pair-end). • As leituras são tipicamente 30 – 400 bp, dependendo da tecnologia usada para sequenciamento do DNA. • Para esse método tem se usado plataformas tipo: Illumina IG, SOLiD e 454.

9. Considerações Prioritárias na montagem • Para garantirumaaltaqualidadenamontagem do transcriptoma, cuidadosparticularesdevemsertomadosnosexperimentos de RNA-Seq. • Na fase de análise de dados, as leiturascurtassãopré-processadaspara remover erros de sequenciamento e outros artefatos. • As leiturassãosubsequentementemontadasnos RNAs originais e entãosuaabundância é avaliada.

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11. Para evitar erros na montagem de RNA, é necessário retirar o passo de amplificação por PCR • Na etapa de amplificação por PCR alguns fragmentos podem ser melhor amplificados que outros prejudicando os dados • Já é possível fazer o sequenciamento sem amplificação usando as plataformas Helicos e Pacific Biosciences, • O sequenciamento através de uma única molécula é possível, porém essas tecnologias ainda sofrem com a alta taxa de erro.

12. Estratégias de Montagem do Transcriptoma • Baseado em três categorias : • Etratégia baseada em referência • Estratégia de novo • Estratégia combinada

13. Estratégia baseada em Referência • Quando existe um genoma de referência o transcriptoma pode ser construido a partir dele. • Esse método inclui três passos: • Alinhamento das leituras sobre o genoma de referência • As leituras sobrepostas em cada locus são agrupadas para construir um gráfico de todas as isoformas possíveis. • O gráfico é analisado para resolver isoformas individuais. • Programas: Blat, TopHat, SpliceMap, MapSplice, GSNAP

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16. Após as leituras serem alinhadas ao genoma, dois métodos são usados para a construção dos gráficos: • Cufflinks - cria um gráfico de sobreposição de todas as leituras que alinham com um único locus para montar isoformas encontrando o mínimo de transcritos que explicam os introns dentro da leitura. • é mais conservativo na escolha de quais os transcritos são re-construidos • Scripture - cria um gráfico que une cada base de um cromossomo e adiciona nas laterais (conexões) entre as bases se existe uma leitura que liga duas bases. • pode produzir um grande conjunto de transcritos de um locus.

17. Vantagens • Pode montar transcritos de baixa abundância; • Pode usar computação paralela • Pode ser feita em máquinas com poucos gb de RAM; • Descobrir novos transcritos que não estão em anotações já existentes; • Descarta artefatos e contaminantes (que não alinham) • Usado para transcriptomas simples: • bactérias, archeaeal, eucarióticos simples • com poucos introns • pouco splicing alternativo

18. Desvantagens • Não é possível sem um genoma de referência; • Depende da qualidade do genoma de referência ; • Genomas podem não ser completos, ter regiões não agrupadas e parcialmente montadas. • Genes que se encontram muito próximos ou sobrepostos podem ser interpretados com um único transcrito • Não une leituras que esteja muito distantes no genoma ou em cromossomos diferentes

19. Estratégia de novo • Não utiliza um genoma de referência; • Se utiliza da redundância das leituras para encontrar sobreposições entre as leituras • Programas usam o gráfico De Brujin para reconstruir transcritos de uma ampla faixa de níveis de expressão e então processar a montagem de contigs e remover redundancias. • Semelhante à montagem de genoma

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22. Vantagens • Nãodepende de um genoma de referência; • Podeprovidenciar um novo conjunto de dados de transcritosparagenomasquenãoapresentaaltaqualidade; • Pode ser usado para encontrar transcritos exógenos ou que estão faltando no genoma; • Não é influenciado por longos introns • Encontra transcritos trans-spliced, resultantes de rearranjos cromossomais • Pode ser utilizado para o transcriptoma de organismos complexos

23. Desvantagens • A montagem de organismos eucariotos complexos pode consumir muita memória RAM • Grande quantidade de dados • Complexidade dos gráficos de Brujin nescessários para analizar os possíveis splicings • Consome dias ou semanasde processamento • Exige maior cobertura(30x) • Suscetível a erros de leitura, pode não diferenciar um erro do sequenciamento de um splicing • Trechos similares(como parálogos) ainda podem ser considerados um só transcrito

24. Estratégia Combinada • A combinação dos dois métodos pode ser utilizada • O alinhamento tem a vantagem da sensibilidade • O De Novo para encontrar transcritos novos e trans-spliced • Realizando o alinhamento primeiro podemos descartar as sequências já conhecidas • Fazendo a montagem De Novo com uma quantidade muito menor de dados • Quando o genoma de referência tem baixa qualidade a montagem De Novo pode ser feita primeiro • Os contigs e singlets são alinhados no genoma e as lacunas podem ser preenchidas com informações do genoma

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26. Cobertura x Custo • Uma questão importante é a cobertura da sequência ou a porcentagem dos transcritos pesquisados, os quais implicam no custo. • Grandes coberturas requerem mais sequenciamento. • Em transcriptomas simples, como da levedura S. cerevisiae, que não tem evidência de splicing alternativo, 30 milhões de leituras de 35 nucleotídeos são suficientes para observar a transcrição de mais de 90% dos genes de células em crescimento sob uma condição unica

28. RNA-Seq revela a localização precisa dos limites da transcrição, com a resolução base a base. • Além disso, pequenas leituras de 30 pb de RNA-Seq nos mostra informação como 2 exons estão conectados, enquanto leituras longas ou leituras curtas por pair-ends poderiam revelar conectividade entre exons múltiplos. • Os resultados de RNA-Seq também mostram alto nível de reprodutibilidade, para ambas as técnicas e replicatas biológicas.

29. Utilizações • Descoberta de pequenos RNAs • Quantificação da expressão em diferentes momentos • Fusão de genes em câncer • Identificação de mutações • Metagenômica

30. Obrigada!