Miroslav Strnad / Dušan Lazár

1. Miroslav Strnad / Dušan Lazár Olomouc Katedra biofyziky, Př.f., UP http://biofyzika.upol.cz Fotosyntéza - temnostní reakce [kap. 8]

2. Obsah • Calvin-Benson-Bassham cyklus (C3 cyklus) a C3 rostliny • Fotorespirace (oxidativní C2 cyklus) • C4 cyklus (Hatch-Slackův cyklus) a C4 rostliny • CAM cyklus a CAM rostliny • Syntéza škrobu a sacharózy • Měření světelných a uhlíkových reakcí fotosyntézy

3. Temnostní fáze (reakce) fotosyntézy Prvotní představa byla, že temnostní fáze fotosyntézy není vůbec závislá na světle. Tato fáze sice není přímo závislá na světle, ale využívá produktů světelné fáze fotosyntézy (NADPH, ATP) => vhodnější název je „uhlíkové“ reakce (fáze) fotosyntézy.

4. Calvin-Benson-Bassham cyklus (pšenice, ječmen, hrach, …) Objevili ho Melvin Calvin a významně přispěli i Andrew Benson a James Bassham (=> CBB cyklus). M. Calvin za tento cyklus dostal v roce 1961 Nobelovu cenu za chemii. Popisuje fixaci CO2 odehrávající se ve stromatu chloroplastů (mezofylových buněk u C3 rostlin). Protože se přímo po fixaci CO2 tvoří 3-uhlíkové sloučeniny, také se nazývá C3-cyklus. C3 cyklus představuje standardní formu fixace CO2 u většiny rostlin (tzv. C3 rostliny). Sumárně lze zapsat jako: 6 CO2 + 12 NADPH + 12 H+ + 18 ATP → C6H12O6 + 6 H2O + 12 NADP+ + 18 ADP + 18 Pi

5. Cyklus má 3 fáze: • kyrboxylaci • redukci • regeneraci

6. Jedná se skutečně o cyklus - karboxylace 3 molekul ribulózy-1,5-bisfosfátu (RuBP) vede ve výsledku k syntéze 1 molekuly glyceraldehydu-3-fosfát (GAP) a poté kregenaraci opět 3 molekul ribulózy-1,5-bisfosfátu. Každá reakce je enyzmatická = reakce je umožněna daným enzymem.

7. Klíčový enyzm cyklu je enzym umožňující karboxylaci 1 molekuly RuBP na 2 molekuly 3-fosfoglycerátu (PGA), nazvývaný ribulózy-1,5-bisfosfát karboxyláza/oxygenáza (Rubisco). Celková reakce je vlastní karboxylace za tvorby nestabilního meziproduktu a následné hydrolýzy. Vstupní CO2 je zabudováno pouze do 1 z molekul PGA.

8. I když Rubisco je klíčový enzym v asimilaci CO2, bylo zjištěno, že rychlost asimilace CO2 je nejvíce kontrolována enzymem sedoheptulóza-1,7-bisfosfatázou a až poté Rubiscem. Vysoké energetické požadavky cyklu naznačují nutnost jeho regulace => v případě kdy není dostatek všech reaktantů je cyklus „vypnutý“ (ve tmě) => některé enzymy cyklu jsou ve tmě samovolně deaktivovány a v případě potřeby následně aktivovány. Aktivace některých enzymů C3 cyklu se děje pomocí thioredoxinů (viz dále). Aktivace Rubisca se děje ve 2 krocích: 1) odstranění nežádoucích látek (carboxyarabinitol-1-fosfát, ale i RuBP) navázaných ve tmě na Rubisco před jeho vlastní aktivací 2) tvorba vlastního aktivního stavu Rubisca

9. ad 1) Děje se pomocí dalšího enzymu – Rubisco aktivázy, která se aktivací Rubisca inaktivuje a poté pomocí ATP a thioredoxinů opět aktivuje. Na obrázku níže vlevo RuBP inhibuje Rubisco, protože je na něho navázané před vlastní aktivací Rubisca (viz dále).

10. ad 2) Rubisco bez navázaných nežádoucích látek musí být nejdříve karbamylováno (navázání CO2) a poté musí přijmout Mg2+ ionty aby bylo aktivní. Při navázání CO2 na Rubisco při jeho karbamalyci, tato molekula CO2 není ta molekula CO2, která se fixuje při karboxylaci RuBP!

11. Redukovaný thioredoxin redukuje disulfidické skupiny (–S-S-) enzymů C3 cyklu a tím je aktivuje. • Nejdříve se však thioredoxin sám musí redukovat a to se děje pomocí elektronů (pocházejících ze světelné fáze fotosyntézy) z feredoxinu a za přítomnosti enyzmu feredoxin/thioredoxin reduktáza. • Pomocí thioredoxinů se v C3 cyklu aktivuje: • fruktoza-1,6-bisfosfat fosfatáza • ribuloza-5-fosfat kináza • sedoheptuloza-1,7-bisfosfat fosfatáza • NADP/glycerladehyd-3-fosfát dehydrogenáza • ale i Rubisco aktiváza

12. Fotorespirace Rubisco, jak už sám název napovídá (karboxylázaoxygenáza), nekatalyzuje pouze fixaci CO2 (karboxylace), ale i opačný proces, to je oxygenaci (= navázání O2, čili dýchaní = respirace). Protože při této reakci (oxygenaci) se opět zpotřebovávají produkty světlené fáze fotosyntézy, tato reakce se nazývá fotorespirace. Protože v cyklu dochází k oxygenaci a 1. meziproduktem fotorespirace je molekula se 2 uhlíky (2-fosfoglykolát), nazývá se sled těchto reakcí jako oxidativní C2 cyklus. Zda-li proběhne asimilace CO2 nebo fotorespirace závisí na koncentraci CO2 a O2. Fotorespirace je tedy jev konkurující asimilaci CO2 a důvod existence fotorespirace není známý.

13. Celý oxidativní C2 cyklus je prostorově rozdělen a probíhá ve 3 organelách – chloroplastech, peroxizomech a mitochondriích. 2-fosfoglykolát je ještě v chloroplastech přeměněn na glykolát, který putuje do peroxizomu, kde je přeměněn na glycin, který dále putuje do mitochondrií, kde je přeměněn na serin, za uvolnění CO2 (proto „dýchání“). Serin je zpět trasportován do peroxizomu, kde je přeměnen na glycerát, který putuje zpět do chloroplastu, kde je přeměněn na 3-fosfoglycerát, který se pak dále účastní C3 cyklu v chloroplastu. Celý cyklus je také propojen přes využití anorganického dusíku (amoniaku, NH4+) uvolněného v mitochondriích při přeměně glycinu na serin. Toto NH4+ putuje z mitochondrií do chloroplastu, kde je zabudováván do glutaminu a následně do kyseliny glutaminové (= glutamát) (oba jsou aminokyseliny), která se dále účastní reakcí v peroxizomu – viz obr. na další straně.

15. Některé rostliny si vyvinuly mechanismy, jak zvyšovat množství CO2 v zásobě a tím eliminovat fotorespiraci. Jedná se o tzv.: 1) C4 rostliny a C4 cyklus 2) CAM rostliny a CAM cyklus C4 rostliny a C4 cyklus (kukuřice, proso, cukrová třtina, …) Protože cyklus u C4 rostlin začíná syntézou 4-uhlíkatých kyselin, cyklus se nazývá C4 cyklus. Cyklus se také nazývá Hatch-Slackův cyklus(objeven v roce 1966 Hatchem a Slackem) C4 cyklus je spojen s rozdílnou anatomií C4 rostlin v porovnání s C3 rostlinami: - U C3 rostlin, pouze mezofylové buňky mají chloroplasty, ve kterých také probíhá i C3 cyklus. - C4 rostliny mají chloroplasty jak v mezofylových buňkách, tak i v buňkách pochev svazků cévních (bundle sheath cells). V jednotlivých typech buněk probíhají jednotlivé fáze C4 cyklu => jednotlivé typy buněk musí být blízko u sebe. Transport metabolitů mezi jednotlivými typy buněk je umožněn pomocí plasmodesmat = kanály v buněčných stěnách rostlinných buňek.

16. Struktura listu C4 rostlin a plasmodesmata

17. C4 cyklus má 4 kroky: 1) Fixace CO2 do fosfoelnolpyruvatu (PEP) za vzniku 4-uhlíkatých kyselin v mezofylových buňkách. 2) Transport těchto kyselin do buněk pochev svazku cévních. 3) Dekarboxylace (= oddělení CO2) těchto kyselin v buňkách pochev svazku cévních za vzniku 3-uhlíkatých kyselin a generování velké koncentrace CO2. Zde probíhá standardní Calvinův cyklus, ale díky velké koncentraci CO2 je minimalizována fotorespirace. 4) Transport 3-uhlíkatých kyselin zpět do mezofylových buněk, kde se z nich regeneruje PEP.

18. Podle toho, jaká 4- a 3-uhlíkatá kyselina vznikánakonci kroků 1 (malát x aspartát) a 3 (pyruvát x alanin) a podle toho, jaký enzym katalyzuje dekarboxylaci na začátku kroku 3, se C4 cyklus ještě rozděluje na 3 další typy.

19. CAM rostliny a CAM cyklus (kaktusy, agáve, ananas, …) CAM = Crassulecean Acid Metabolism, pojmenováno podle čeledi rostlin Crassulaceae = tlusticovité, u kterých byl tento cyklus poprvé objeven. Na rozdíl od C4 cyklu, kde fixace CO2 a karboxylace jsou prostorově odděleny, u CAM cyklu je fixace CO2 a karboxylace oddělena časově: - Příjem CO2 se děje v noci, kdy jsou otevřená stomata (= průduchy) rostlin. V noci také dochází k fixaci CO2 do PEP za vzniku koncového produktu kyseliny jablečné (malic acid), která se uchovává ve vakuolách. - Karboxylce se děje ve dne, kdy jsou stomata uzavřena: ve dne kyselina jablečná vystupuje z vakuol, mění se na malát a z toho se dekarboxylací uvolní CO2, které je následně použito ke karboxylaci ve standardním C3 cyklu. Protože ve dne mají CAM rostliny uzavřená stomata, hromadí se ve dne u CAM rostlin CO2, čímž se opět eliminuje fotorespirace (jako u C4 cyklu). Navíc, protože při zavřených průduších nedochází k transpiraci (= vypařování vody), CAM cyklus výrazně šetří vodou v rostlině => je převážně u rostlin žijících v suchém prostředí.

20. Noční fixace CO2 do PEP a vznik malátu se děje v cytoplazmě dané buňky. Malát opětovně vzniklý ve dne se dekarboxyluje opět v cytoplazmě a produkty dekarboxylace (CO2 a pyruvát) putují do chloroplastu, kde jsou použity (ve dne) pro karboxylaci ve standradním C3 cyklu a syntéze škrobu (starch), který je v noci zpětně použit na tvorbu PEP.

21. Protože 2 protichůdné reakce, karboxylace PEP v noci a dekarboxylace malátu ve dne, probíhají v cytoplazmě, ale v jinou dobu, je potřeba existence nějaké časové regulace => PEP-karboxyláza (Pepka) je v noci pomocí kinázy fosforylována a tím je převedena do aktivního stavu, který není cytlivý na malát a naopak ve dne je Pepka fosfatázou defosforylována do stavu, jehož aktivita je inhibována malátem. Fosforylace PEP-karboxylázy pomocí kinázy je žízena expresi genů kinázy v odezvě na denní rytmus, kde zpětnovazebná regulace exprese kinázy je řízena pravděpodobně malátem z cytoplasmy, jehož množství je řízeno denním rytmem.

22. Syntéza škrobu a sacharózy Jak již bylo uvedeno u C3 cyklu, karboxylace 3 molekul ribulózy-1,5-bisfosfátu (RuBP) vede ve výsledku k syntéze 1 molekuly glyceraldehydu-3-fosfát (GAP; = triozofosfát, TP). Tyto molekuly TP jsou použity pro syntézu škrobu a sacharózy. Syntéza škrobu a sacharózy jsou konkurující si reakce. Škrob se tvoří v chloroplastech a sacharóza v cytoplazmě buňky. Zda-li se bude tvořit škrob nebo sacharóza je převážně řízeno koncentrací anorganického fosforu (ortofosfát, Pi) v cytoplazmě. Pi vstupuje/vystupuje do/z chloroplastu záměnou za TP pomocí Pi translokátorů. Je-li hodně Pi v cytoplazmě, je tento Pi zaměněn za TP z chloroplastu a tento TP v cytoplazmě stimuluje enzym UDP-glukozapyrofosforyláza a dojde ke tvorbě sacharózy. Opačně, je-li Pi v cytoplazmě málo, TP zůstává v chloroplastu a Pi v cytoplazmě – Pi v cytoplazmě působí inhibičně na předchozí enzym => nedochází ke tvorbě sacharózy v cytoplazmě, ale ke tvorbě škrobu v chloroplastech.

24. Pro regulaci syntézy sacharózy a štěpení cukrů (glykolýza) v cytoplazmě je důležitá vzájemná přeměna fruktóza-1,6-bisfosfátu na fruktóza-6-fosfát enzymem fruktóza-1,6-bisfosfatáza a opačně enzymem fruktóza-6-fosfát kináza. Tyto enzymy jsou buď inhibované nebo aktivované fruktóza-2,6-bisfosfátem, jehož tvorba je také regulována metabolity C3 cyklu.

30. Měření světelných a uhlíkových reakcí fotosyntézy Absorpční spektra a kinetika: excitovaný nebo základní stav, ale i redukovaný nebo oxidovaný stav molekuly absorbuje energii při charakteristických vlnových délkách. Sledováním poměrů absorpcí (excitovaný x základní stav a redukovaný x oxidovaný stav) lze zjistit počáteční stavy molekul. Sledováním kinetiky změn absorpce lze zjistit rychlostní konstanty „přeměny“ molekul, to je přenosu energie a elektronů. Možno měřit v časech od stovek femtosekund (přenos energie) po sekundy (přenos elektronů). Metoda je vhodná pro studium světelné fáze fotosyntézy, hlavně okamžitě po osvětlení, kdy ještě nefungují uhlíkové reakce fotosyntézy a měřené absorpční změny odrážejí pouze světelné reakce fotosyntézy. Příklad – měření kinetiky absorpce při 820 nm odráží redoxní stav převážně P700+, ale i oxidovaného PC

31. fotochemie absorpce světla ↑ využití světla na fotochemii pak ↓ emise fluorescence a naopak fotosyntetický aparát disipace na teplo emise fluorescence Fluorescenční spektra a kinetika: fluorescence představuje konkurenční způsob využití excitační energie k fotosyntetickému využití => funguje-li fotosyntéza je emise fluorescence velká a naopak. Opět lze měřit spektra nebo kinetiku a metoda je opět vhodná pro studium světelné fáze fotosyntézy. Příklad – měření kinetiky fluorescence – tzv. OJIP křivky

32. Rychlost vývoje O2: možno měřit polarograficky nebo absorpčně (tzv. Hillovy reakce). Časně po osvětlení (do 1 sekundy) odráží převážně světelnou fázi fotosyntézy, v delších časech pak i uhlíkovou fázi fotosyntézy. Rychlost asimilace CO2: měří se při dané intenzitě světla a dané koncentraci CO2. Z měření lze vyhodnotit závislost rychlosti asimilace CO2 (P) na intenzitě světla (I) – tzv. PI křivka nebo na koncentraci CO2 – tzv. CO2 křivka. Metoda je vhodná převážně pro studium uhlíkové fáze fotosyntézy, ale odráží v sobě i světelnou fázi fotosyntézy. Příklad – PI křivky