1 / 24

Określanie mechanizmów reakcji enzymatycznych Przykłady

Enzymologia-6. Określanie mechanizmów reakcji enzymatycznych Przykłady. Enzym hydrolityczny rozkładający peptydoglikan ściany komórkowej bakterii. Lizozym. Schemat struktury peptydoglikanu. Reakcja katalizowana przez enzym. Hydroliza wiązania glikozydowego między atomem węgla

jasia
Download Presentation

Określanie mechanizmów reakcji enzymatycznych Przykłady

An Image/Link below is provided (as is) to download presentation Download Policy: Content on the Website is provided to you AS IS for your information and personal use and may not be sold / licensed / shared on other websites without getting consent from its author. Content is provided to you AS IS for your information and personal use only. Download presentation by click this link. While downloading, if for some reason you are not able to download a presentation, the publisher may have deleted the file from their server. During download, if you can't get a presentation, the file might be deleted by the publisher.

E N D

Presentation Transcript

  1. Enzymologia-6 Określanie mechanizmów reakcji enzymatycznych Przykłady

  2. Enzym hydrolityczny rozkładający peptydoglikan ściany komórkowej bakterii Lizozym Schemat struktury peptydoglikanu Reakcja katalizowana przez enzym Hydroliza wiązania glikozydowego między atomem węgla C-1 reszt kwasu N-acetylomuraminowego i atomęm C-4 N-acetyloglukozaminy

  3. Model przestrzenny cząsteczki lizozymu

  4. Wiązania wodorowe pomiędzy (NAG)3 i lizozymem

  5. Sposób wiązania (NAG)6 z lizozymem Kolor żółty - (NAG)6 ; kolor niebieski – reszty aminokwasowe enzymu; Kolor czerwony – reszty aminokwasowe enzymu biorące bezpośredni udział w katalizie

  6. Struktura części centrum aktywnego lizozymu. Kolorem żółtym oznaczono atomy pierścieni D i E substratu (NAG)6

  7. Badanie specyficzności substratowej lizozymu Porównanie szybkości hydrolizy oligomerów NAG • NAG2 0 NAG5 4 000 • NAG3 1 NAG6 30 000 • NAG4 8 NAG8 30 000 • Produkty hydrolizy: NAG6 NAG4 + NAG2

  8. Analog substratu, laktonowa pochodna (NAG)4, wiąże się z enzymem 3 600 razy silniej niż (NAG)4. Wniosek: związek jest analogiem stanu przejściowego

  9. B B D D E E F F A A C C B C D A B C Obraz struktury kompleksu enzym:NAM-NAG-NAM. • Ligand zajmuje miejsce B-C-D, a nie A-B-C, bo NAM jest zbyt duży • aby zająć miejsce C. NAM w miejscu D przyjmuje konformację półkrzesłową

  10. Określenie miejsca hydrolizy substratu Które wiązanie ulega hydrolizie? • Informacje wyjściowe: • w peptydoglikanie hydrolizowane jest wiązanie NAM-NAG • (NAG)3 nie ulega hydrolizie; • NAM nie może zajmować miejsca C (zawada przestrzenna)

  11. Ustalenie roli reszt katalitycznych Profil zależności szybkości reakcji od pH Klasyczna krzywa dzwonowa. Maksimum około pH = 5.0 Spadek aktywności po stronie alkalicznej – wynik jonizacji Glu-35 Spadek aktywności po stronie kwasowej – wynik protonowania Asp52 Modyfikacja chemiczna Estryfikacja Asp52 – całkowita utrata aktywności; związanie substratu chroni enzym przed inaktywacją

  12. Mechanizm reakcji katalizowanej przez lizozym Etap I – protonowanie atomu tlenu wiązania glikozydowego przez Glu 35 Etap II – przyłączenie anionu OH- z wody do jonu karboniowego i H+ do grupy COO- reszty Glu 35

  13. Chymotrypsyna Enzym proteolityczny, wytwarzany przez trzustkę w formie proenzymu (chymotrypsynogen). Chymotrypsyna należy do grupy proteaz serynowych Specyficzność substratowa ustalona na podstawie peptydów modelowych Reszta seryny 195 jest szczególnie reaktywna. Selektywna modyfikacja przez DIPF oraz PMSF

  14. Modyfikacja chemiczna Ukierunkowana mutageneza Mutant Asp102Asn wykazuje kkat 5000 razy niższe niż enzym typu dzikiego TPCK – specyficzny inaktywator chymotrypsyny Ser195, His57 i Asp102 tworzą triadę katalityczną TPCK alkiluje resztę His 57

  15. Struktura przestrzenna chymotrypsyny

  16. Wiązanie substratu Hydrofobowa kieszeń chymotrypsyny; miejsce rozpoznania i wiązania substratu Porównanie miejsc wiązania substratu w niektórych proteazach serynowych

  17. Określenie mechanizmu katalizy Detekcja intermediatów - acyloenzym Acyloenzym powstający w wyniku działania octanu p-nitrofenylu na chymotrypsynę można wyizolować, jeżeli reakcję prowadzi się w niskim pH

  18. Określenie mechanizmu katalizy Detekcja intermediatów – tetraedryczny stan przejściowy 1. Niskotemperaturowy 13C NMR Przejściowy produkt reakcji można wykryć poprzez identyfikację sygnału pochodzącego od znakowanego atomu węgla 2. Inhibitory – analogi stanu przejściowego

  19. Mechanizm reakcji katalizowanej przez chymotrypsynę

  20. Stabilizacja stanu przejściowego w centrum aktywnym

  21. Analogi stanu przejściowego w medycynie

  22. Stan przejściowy Tetraedryczny związek pośredni Enzym Lepszy analog stanu przejściowego ale chemicznie niestabilny Stan przejściowy Analog stanu przejściowego

  23. Penicylina – analog stanu przejściowego D-alanylo-D-alaniny

More Related