1 / 43

SEROLO ŠKE REAKCIJE

SEROLO ŠKE REAKCIJE. INSTITUT ZA JAVNO ZDRAVLJE VOJVODINE Prof.dr IVANA HRNJAKOVIĆ CVJETKOVIĆ. DEFINICIJA SEROLOŠKIH REAKCIJA. SEROLOŠKE REAKCIJE SU REAKCIJE ANTIGEN (Ag) ANTITELO (At) U USLOVIMA IN VITRO. ANTIGEN + ANTITELO KOMPLEKS koji može da se vidi ili dokaže na drugi način.

jabari
Download Presentation

SEROLO ŠKE REAKCIJE

An Image/Link below is provided (as is) to download presentation Download Policy: Content on the Website is provided to you AS IS for your information and personal use and may not be sold / licensed / shared on other websites without getting consent from its author. Content is provided to you AS IS for your information and personal use only. Download presentation by click this link. While downloading, if for some reason you are not able to download a presentation, the publisher may have deleted the file from their server. During download, if you can't get a presentation, the file might be deleted by the publisher.

E N D

Presentation Transcript

  1. SEROLOŠKE REAKCIJE INSTITUT ZA JAVNO ZDRAVLJE VOJVODINE Prof.dr IVANA HRNJAKOVIĆ CVJETKOVIĆ

  2. DEFINICIJA SEROLOŠKIH REAKCIJA • SEROLOŠKE REAKCIJE SU REAKCIJE ANTIGEN (Ag) ANTITELO (At) U USLOVIMA IN VITRO. • ANTIGEN + ANTITELO KOMPLEKS koji može da se vidi ili dokaže na drugi način

  3. DEFINICIJA SEROLOŠKIH REAKCIJA • NA OSNOVU STVORENOG KOMPLEKSA PRIMENOM POZNATOG ANTIGENA MOŽE SE DOKAZATI NEPOZNATO ANTITELO ILI OBRNUTO (primenom poznatog antitela dokazati nepoznati antigen)

  4. PRIMENA SEROLOŠKIH REAKCIJA • U DIJAGNOSTICI U VIRUSOLOGIJI, BAKTERIOLOGIJI, PARAZITOLOGIJI ZA POSTAVLJANJE ETIOLOŠKE DIJAGNOZE ODNOSNO UTVRĐIVANJE UZROČNIKA BOLESTI • U TIPIZACIJI KRVNIH GRUPA ERITROCITA I HISTOKOMPATIBILNIH ANTIGENA LEUKOCITA • ZA DOKAZIVANJE PROTEINA SERUMA, ONKOFETALNIH ANTIGENA, AUTOANTITELA, KOMPONENTI KOMPLEMENTA

  5. VRSTE SEROLOŠKIH REAKCIJA • SEROLOŠKE REAKCIJE ETIOLOŠKOG SPECIFITETA Ag su napravljeni od uzročnika bolesti koju dokazujemo • SEROLOŠKE REAKCIJE SLUČAJNOG SPECIFITETA Ag nisu napravljeni od uzročnika bolesti nego su samo slučajno sa uzročnikom antigenski srodni pa mogu da reaguju sa antitelima nastalim u infekciji tim uzročnikom

  6. SEROLOŠKE REAKCIJE ETIOLOŠKLOG SPECIFITETA • IMUNOENZIMSKI TEST ELISA • IMUNOFLUORESCENTNI TEST IFT • RADIOIMUNOESEJ RIA • NEUTRALIZACIONI TEST NT • REAKCIJA VEZIVANJA KOMPLEMENTA • REAKCIJA INHIBICIJA HEMAGLUTINACIJE • AGLUTINACIJA i PRECIPITACIJA

  7. SEROLOŠKI TESTOVI KOJI KORISTE OBELEŽENA ANTITELA • TESTOVI IMUNOFLOURESCENTNE MIKROSKOPIJE (IFT) • IMUNOENZIMSKI TESTOVI (ELISA) • RADIOIMUNOTESTOVI (RIA) • OVIM TESTOVIMA DOKAZUJU SE KLASE IMUNOGLOBULINA IgM, IgG, Ig A, IgE zavisno od specifiteta antitela koje je obeleženo enzimom, fluorohromom ili radioaktivnim izotopom

  8. TESTOVI IMUNOFLUORESCENTNE MIKROSKOPIJE IFT • 1.DIREKTNA IMUNOFLUORESCENTNA MIKROSKOPIJA • PRIMENJUJE SE ZA DOKAZIVANJE ANTIGENA MIKROORGANIZAMA • IZVODI SE NA PREDMETNOM STAKLU • POTREBAN JE FLUORESCENTNI MIKROSKOP KOJI IMA ŽIVINU SIJALICU I SPECIJALNE FILTRE TE EMITUJE UV ZRAKE

  9. TESTOVI IMUNOFLUORESCENTNE MIKROSKOPIJE IFT • 1.DIREKTNA IMUNOFLUORESCENTNA MIKROSKOPIJA princip testa • bolesnički uzorak( u komedokazujemo Ag ) fiksiran JE na predmetnom staklu + At specifično za Ag obeleženo fluorohromom PRI ISPIRANJU SE NE SPIRA ako je formiran kompleks Ag-At • Ovako pripremljeni uzorak se MIKROSKOPIRA NA IMUNOFLUORESCENTNOM MIKROSKOPU

  10. TESTOVI IMUNOFLUORESCENTNE MIKROSKOPIJE IFT POZITIVAN IFT TEST • UKOLIKO JE U BOLESNIČKOM UZORKU PRISUTAN ANTIGEN SPECIFITETA PRIMENJENIH At obeleženih fluorohromom u preparatu se javlja FLUORESCENCIJA HERPES SIMPLEX VIRUS U ĆELIJAMA VEZIKULA

  11. TESTOVI IMUNOFLUORESCENTNE MIKROSKOPIJE IFT • 2.INDIREKTNA IMUNOFLUORESCENTNA TEHNIKA (IIFT) • 2.a IIFT ZA DOKAZIVANJE At • 2.b IIFT ZA DOKAZIVANJE Ag

  12. FTA – Indirektna imunofluorescentna tehnika • Dokazuju se i Ag i At • Indirektna FTA za Ag • +Ag + At inkubacija, ispiranje • Dodavanje antiAt markiranog fluorohromom Ag-At-antiAtmark. Inkubacija,ispiranje • Fluorescentni mikroskop UV zraci • Kompleks Ag-At-Atmark.FLUORESCIRA

  13. Pozitivan INDIREKTNI IMUNOFLUORESCENTNI TEST ZA ANTIGEN RSV

  14. IMUNOFLUORESCENTNA TEHNIKA ZA DOKAZIVANJE CMV ANTIGENEMIJE • PREDNOSTI • kvalitet uzorka se vidi,mora sadržati intaktne virusom inficirane ćelije • jednostavna priprema preparata i dobijanje rezultata za 1-2h • NEDOSTACI • subjektivna metoda • obučenost za mikroskopiranje

  15. FTA – Indirektna imunofluorescentna tehnika za Ag NEGATIVAN TEST • Ø + At( inkubacija,ispiranje) • Dodavanje antiAt markiranog FITC (inkubacija,ispiranje) • UV zraci fluorescentnog mikroskopa • NEMA FLUORESCENCIJE jer se At obeležena hluorofromom spiraju

  16. PRINCIP INDIREKTNOG IMUNOFLUORESCENTNOG TESTA PRIMENOM POZNATOG Ag DOKAZUJEMO At TOG SPECIFITETA U SERUMU

  17. FTA – Antrikomplementarna imunofluorescentna metoda • Za dokazivanje Ag • +Ag + At + C(inkubacija, ispiranje) • Ag-At-C + antiC3markiran fluorohromom (inkubacija, ispiranje) • Fluorescentni mikroskop UV :kompleks Ag-At-C- antiC3markiran FLUORESCIRA

  18. ELISA TESTOVI • Za dokazivanje Ag 1.DIREKTNA SENDVIČ ELISA 2.INHIBICIONA 3.KOMPETITIVNA • Za dokazivanje At 1.DIREKTNA KOMPETITIVNA 2.INDIREKTNA ELISA

  19. SEROLOŠKA DIJAGNOZA ELISA TEST ELISA test

  20. DIREKTNA SENDVIČ ELISA • Za dokazivanje Ag Bazenčić obložen At specifičnim za Ag koji se dokazuje • Dodavanje ispitujućeg uzorka • Dodavanje At specifičnih za traženi Ag markiranih enzimom (E) (inkubacija, ispiranje) • Dodavanje substrata • KVANTITATIVNA ELISA (intenzitet boje ukazuje na količinu ag u uzorku)

  21. INHIBICIONA ELISA • Za dokazivanje Ag • Ag (isti kao onaj koji se dokazuje) je vezan za ploču • Dodaje se ispitujući bolesnički uzorak • Dodaju sa At obeležena E specifična za Ag koji se dokazuje (inkubacija,ispiranje) • Dodavanje substrata • IZOSTANAK POJAVE BOJE +ELISA (obeležena antitela imaju veći afinitet vezivanja za antigen iz uzorka)

  22. KOMPETITIVNA ELISA • Za Ag • Bazenčić je obložen At specifiteta Ag koji se dokazuje • Dodaje se ispitujući uzorak • Dodaje se Ag markiran E (kao ag koji se dokazuje) (inkubacija,ispiranje) • Dodaje se substrat • IZOSTANAK POJAVE BOJE +ELISA jer Ag iz uzorka ima veći afinitet vezivanja od obeleženog Ag koji će se sprati

  23. ELISA ZA DOKAZIVANJE ANTITELA DIREKTNA KOMPETITIVNA At iz ispitujućeg seruma imaju većI afinitet vezivanja za Ag od enzimom obeleženih At • BAZENČIĆ PLOČE ZA MIKROTITRACIJU JE OBLOŽEN ANTIGENOM • DODAJE SE BOLESNIČKI SERUM I ANTITELA SPECIFITETA ANTIGENA OBELEŽENA ENZIMOM • INKUBACIJA , PA ISPIRANJE I DODAVANJE SUBSTRATA PRISUSTVO BOJE NEGATIVNA ELISA NEMA POJAVE BOJE POZITIVNA DIREKTNA KOMPETITIVNA ELISA

  24. PRINCIP INDIREKTNOG ELISA TESTA

  25. INDIREKTNA ELISA • POJAVA BOJE u indirektnom ELISA testu = + ELISA • INTENZITET BOJE GOVORI O KOLIČINI ANTITELA U SERUMU .TEST MOŽE BITI KVANTITATIVAN • ENZIMI koji se primenjuju u ELISA TESTU ALKALNA FOSFATAZA PEROKSIDAZA SUPSTRAT koji se primenjuje u ELISA TESTU ORTOFENILENDIAMIN

  26. ANALYSER IP2 MIKROPLATE READER APARATI ZA ELISA TESTOVE

  27. INTERPRETACIJA SEROLOŠKIH REZULTATA

  28. KLASIČNI SEROLOŠKI TESTOVI • NE DOKAZUJU SE ANTITELA PO KLASAMA VEĆ UKUPNI IMUNOGLOBULINI • REAKCIJA VEZIVANJA KOMPLEMENTA RVK • NEUTRALIZACIONI TEST NT • REAKCIJA INHIBICIJA HEMAGLUTINACIJE RIH • AGLUTINACIJA • PRECIPITACIJA mogu se dokazati i klase imunoglobulina

  29. REAKCIJA VEZIVANJA KOMPLEMENTA (RVK) • INAKTIVACIJA KOMPLEMENTA U SERUMU KOJI SE TESTIRA (inkubacijom na 56°C 30 minuta) • I FAZAAt (dvostruka stepenasta razređenja seruma od ¼ do 1/256) + Ag + C (inkubacija 90min /37°C ili 18h/4°C)

  30. RVK • FAZA II • DODAJE SE HEMOLITIČKI SISTEM koji ima ulogu indikatora ( reakciju Ag A t čini vidljivom) INKUBACIJA 30MIN /37°C • HEMOLITIČKI SISTEM se sastoji od HEMOLIZINA(INAKTIVISANI SERUM KUNIĆA SA ANTITELIMA PROTIV OVČIJIH ERITROCITA) I OVČIJIH ERITROCITA

  31. RVK POZITIVNA • ISPITUJUĆI SERUM SADRAŽI At SPECIFIČNA ZA PRIMENJENI Ag FAZA I Ag+At+C= Ag-At –C (formira se kompleks Ag At i aktivira se komplement FAZA II Ag-At-C +Hem+OE =OE OSTAJU INTAKTNI • RVK POZITIVNA HEMOLIZA NEGATIVNA • OE ovčiji eritrociti/Hem hemolizin

  32. RVK NEGATIVNA • ISPITUJUĆI SERUM NE SADRŽI ANTITELA SPECIFIČNA ZA PRIMENJENI ANTIGEN • Ag + C= Ag+C ( komplement se ne aktivira u fazi I jer se ne stvara kompleks Ag- At) • FAZA II Ag+C+Hem+OE = Ag+Hem-OE-C (hemolitički sistem aktivira C) • LIZA ERITROCITA RVK NEGATIVAN

  33. TITAR • REZULTAT RVK SE IZRAŽAVA U TITROVIMA • TITAR JE NAJVEĆE RAZREĐENJE ISPITUJUĆEG SERUMA KOJE JOŠ UVEK DAJE POZITIVNU SEROLOŠKU REAKCIJU

  34. OČITAVANJE RVK TESTA • RVK TEST MOŽE DA SE IZVODI U EPRUVETAMA ILI NA PLOČAMA ZA MIKROTITRACIJU

  35. NEUTRALIZACIONI TEST (NT) • 1.ZA IDENTIFIKACIJU IZOLOVANOG VIRUSA - VIRUS NEUTRALIZACIONI TEST • 2.ZA ODREĐIVANJE TITRA NEUTRALIŠUĆIH ANTITELA U SERUMU SERUM NEUTRALIZACIONI TEST

  36. VIRUS NEUTRALIZACIONI TEST princip testa • UKLANJANJE NESPECIFIČNIH INHIBITORA :30min/56°C • VIRUSNI IZOLAT (živi virus) dvostruko stepenasto razređen + • ANTITELA specifična za virus • Inokuliše se u KULTURU ĆELIJA • IZOSTANAK CPE POZITIVAN NT • KONTROLA:VIRUS U kulturi bez At CPE+ Inkubacija 30min/37°C

  37. CITOPATOGENI EFEKAT (CPE) • CPE sve citopatološke promene na ćelijama u kojima se razmnožava virus • CPE ADENO virusa uvećane,zaokružene ćelije,grupisane u tipične nakupine. Cpe adeno virus

  38. CITOPATOGENI EFEKAT • RSV sincicijumi i blede eozinofilne inkluzije u citoplazmi • Javlja se između 3 -7 dana

  39. Citopatogeni efekat HSV virusa • IZOLACIJA U KULTURI ĆELIJA CPE HSV na kulturi ćelija

  40. SERUM NEUTRALIZACIONI TEST princip testa • UKLANJANJE NESPECIFIČNIH INHIBITORA U ISPITUJUĆEM SERUMU • Ag(živi virus) + ISPITUJUĆI SERUM • KULTURA ĆELIJA (inkubacija na 35°C) • CPE – NT + CPE + NT – • REZULTATI SE IZRAŽAVAJU U TITROVIMA (1/10,1/20 I sl.)

  41. REAKCIJA INHIBICIJE HEMAGLUTINACIJE princip testa • 1.INAKTIVACIJA NESPECIFIČNIH INHIBITORA HEMAGLUTINACIJE U SERUMU • 56°C/30MIN • PERJODATOM,RDE,TRIPSINOM • 2.RAZREĐIVANJE SERUMA • 3.DODAVANJE ANTIGENA HEMAGLUTININA /INKUBACIJA SOBNA TEMP/45MIN

  42. RIH OČITAVANJE • 4.DODAVANJE ERITROCITA (Er) koji su indikatori reakcije antitela i virusa • 5.OČITAVANJE RIH

  43. Interpretacija rezultata klasičnih seroloških testova

More Related