PAIVI M. OJALA, BEATE SODEIK, MELANIE W. EBERSOLD, ULRIKE KUTAY, and ARI HELENIUS

1. Herpes Simplex Virus Type 1 Entry into Host Cells:Reconstitution of Capsid Binding and Uncoatingat the Nuclear Pore Complex In Vitro PAIVI M. OJALA, BEATE SODEIK, MELANIE W. EBERSOLD, ULRIKE KUTAY, and ARI HELENIUS • Department of Cell Biology, Yale University, New Haven, Connecticut,and • Institute of Biochemistry, ETH-Zürich, Zürich, Switzerland • MOLECULAR AND CELLULAR BIOLOGY, July 2000

2. HSV-1 • Herpesviridae • Virus enveloppé • Capside icosaédrique : 6 protéines  VP5 • Tégument • Protéine majeur VP1-3 (VP1/2) • VP11/12, VP13/14, VP 16, VP18.8 & VP22 • ADN db linéaire

3. Pénétration dans la cellule hôte • Interaction avec la membrane cellulaire • Glycoprotéines gB, gC • Heparan sulfate chain • Fusion enveloppe/membrane • gD  corécepteurs • HVEM (HveA ou TNFRSF14) & Ig • Transport au travers du cytosol vers le noyau • Micotubules • Dyneim • Liaison de la capside au NPC • Décapsidation de l’ADN dans le noyau

4. Complexe du pore nucléaire • Grand complexe protéique 125 000 kDa • Permettent les échanges entre noyau et cytoplasme • Transport actif/passif • Import/export • 3000 à 5000 pores par noyau • Structure : • Composé de nucléoporines • Diamètre intérieur 45 nm • 2 anneaux • 8 fibrilles sur la face cytoplasmique • Structure en panier sur la face nucléaire

5. But de l’article • Analyse de l’interaction de la capside de HSV-1 avec le NPC • Caractérisation biochimique de la libération de l’ADN • Reconstitution in vitro de la liaison et de la décapsidation • Déterminer les paramètres de liaison et d’expulsion de l’ADN de HSV-1 au niveau du noyau

6. In vivo : Décapsidation de HSV-1 dans les cellules Vero • ME : Infection de cellules Vero avec HSV-1 en présence de cyclohéximide • Résultats : • Liaison de la capside à la membrane nucléaire à H1 après pénétration • Localisation à 50 nm d’un NPC • Attachement aux filaments issus du pore • Perte rapide de l’ADN : 2 à 4h après infection

7. In vivo : Décapsidation de HSV-1 dans les cellules Vero Caractérisation biochimique : • Libération de l’ADN • Apparition de capsides vides Méthode : • Culture de cellules Vero  inoculation virus [3H]thymidine ou [35S]cystéine-méthionne • Traitement au Cytochalasine D • Protéinase K 1h • Lyse : Triton X-100 • 30 min • 4 h • Centrifugation : culot • gradient de saccharose • compteur à scintillation

8. Liaison des capsides au noyau in vitro • Capsides isolées • Incubation avec des noyaux d’hépatocytes de rat • Présence ou absence de cytosol • Évaluation liaison : Microscopie après IFI • Ac anti capside : anti-ROM V • Ac anti NPC : Mab414, Anti-RL1, Anti-RL2 & anti-WGA

9. Caractérisation des capsides purifiées • Capsides isolées de virus matures • Élimination de enveloppe : • Triton X100 • Tampon hypersalé • SDS-page ou immunoblot avec ou sans trypsine Présence des composants du tégument liés à capside Ceux-ci sont éliminés par la trypsine Structure de la capside intacte

10. Liaison nucléaire • Analyse in vitro : Liaison des capsides de HSV-1 en présence de cytosol • Microscopie confocale/immunofluorescence • Anti-Rom V  VP-5 & Mab414  nucléoporines Les capsides sont localisées exclusivement au niveau de l’enveloppe nucléaire • Liaison au noyau est indépendant : • De la température • De l’ATP

11. Liaison nucléaire In vitro : Liaison des capsides de HSV-1 en absence de cytosol Blocage de l’import nucléaire par RanQ69L Faibles liaisons en absence de cytosol Importine β est impliquée dans la liaison de la capside Remarques : Pas de rôle de l’importine α Pas de rôle de la transportine, facteur importine β-like

12. Liaison nucléaire In vitro : Rôles de l’Importine β et de RanQ69L L’amarrage de la capside de HSV-1 au noyau médié par l’importine β est sous la dépendance du cycle de Ran GTPase.

13. Liaison nucléaire In vitro : Liaison préférentielle aux NPC : • Anticorps dirigés contre les protéines du NPC : blocage de la liaison des protéines karyophiliques • Mab414  GFXFG des nucléoporines • Anti-RL1 & RL2  O-linked N-acétylglucosamine • Anti-WGA  lectine s’associant au NPC • Anticalnexine Nombreux facteurs intervenant dans la liaison Liaison in vitro au NPC similaire à celle observée dans les cellules infectées in vivo

14. Liaison nucléaire In vitro : réduction de liaison de la capside par un traitement à la trypsine Evaluation de du rôle des protéines de la capside dans sa liaison au NPC : Traitement à la trypsine  action sélective sur les protéines du tégument VP1-3, VP13/14, VP16 & VP22 Baisse de la liaison de 85 % / capsides non traitées Les protéines du tégument sont nécessaires à la liaison de la capside au NPC

15. Décapsidation in vitro • Incubation de capsides marquées au [3H]thymidine avec des noyaux • Analyse de l’accessibilité de l’ADN viral aux DNAses : TCA précipitation Décapsidation de HSV-1 BSA : capsides non traitées BSA et noyaux de foie de rat BSA et lysat de réticulocytes de lapin BSA, lysat de réticulocytes de lapin et noyaux de foie de rat en présente d’ATP-regenerating system SDS : digestion complète Inhibition de la décapsidation : BSA, lysat de R, nx d’hépatocytes & ATP-RS : Mab414 Anti-importine β Anti-WGA Déplétion en ATP GTPγS L’interaction spécifique des capsides avec les NPC in vitro induit la libération de l’ADN viral L’efficacité de la libération est augmentée par des facteurs notamment métaboliques présents dans le cytosol

16. Conclusion et discussion • Meilleure compréhension de l’évolution de HSV-1 dans la cellule • Désassemblage commence à la membrane • Perte d’une partie des protéines du tégument • Liaison aux dyneim • Liaison spécifique de la capside au NPC • Import médié par importine β • Plutôt que importine α • HIV : cycline B1 et protéines Tat & Rev • Ran GTP dépendant

17. Conclusion et discussion • Libération de l’ADN identique dans la cellule et in vitro • Liaison aux protéines du NPC induit la libération • VP1-3 • Contient NLS • Similarité avec le HIV • Capsides nouvellement formées • Pas d’affinité pour les NPC • Acquisition de l’adressage nucléaire durant l’assemblage ou hors de la cellule

18. Merci de votre attention !