Jel elektroforez sds page
This presentation is the property of its rightful owner.
Sponsored Links
1 / 28

JEL ELEKTROFOREZİ SDS-PAGE PowerPoint PPT Presentation


  • 374 Views
  • Uploaded on
  • Presentation posted in: General

JEL ELEKTROFOREZİ SDS-PAGE. FFMBG103. JEL ELEKTROFOREZİ. Büyüklük, yük ve konformasyon bakımından birbirlerinden farklılık gösteren yüklü makromolekülleri (protein, nükleik asit) iyonik bir ortamda birbirinden ayırtetmek için kullanılır.

Download Presentation

JEL ELEKTROFOREZİ SDS-PAGE

An Image/Link below is provided (as is) to download presentation

Download Policy: Content on the Website is provided to you AS IS for your information and personal use and may not be sold / licensed / shared on other websites without getting consent from its author.While downloading, if for some reason you are not able to download a presentation, the publisher may have deleted the file from their server.


- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - E N D - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -

Presentation Transcript


Jel elektroforez sds page

JEL ELEKTROFOREZİSDS-PAGE

FFMBG103


Jel elektroforez

JEL ELEKTROFOREZİ

  • Büyüklük, yük ve konformasyon bakımından birbirlerinden farklılık gösteren yüklü makromolekülleri (protein, nükleik asit) iyonik bir ortamda birbirinden ayırtetmek için kullanılır.

  • Protein yada DNA/RNA elektriksel bir ortamda makromolekülün yükü ile doğru orantılı ancak şekli ve büyüklüğü ile ters orantılı bir hızda hareket ederler.

  • Aminoasit, peptit, nukleotit, nukleik asit; yüklü moleküller

  • Net yüke göre elektriksel ortamda hareket, ya pozitif (anot) ya da negatif (katot) kutuba

  • DNA/RNA fosfat grupları nedeni ile sabit – yüklü olup pozitif elektroda doğru hareket ederler


Jel elektroforez sds page

Bir partikülün göç oranını etkileyen faktörler

  • Elektriksel alan gücüne

  • Partikülün net yüküne

  • Elektroforez ortamının yoğunluğu


Elektroforez tipleri

Elektroforez tipleri

  • Poliakrilamit jel elektroforezi (PAGE): proteinler ve DNA sekans analizinde 500 bç nin altındaki nükleik asitleri ayrılabilir

  • Native PAGE

  • Native Gradient PAGE

  • Urea PAGE

  • SDS PAGE

  • SDS Gradient PAGE

  • IEF

  • 2D PAGE

  • Western Blot

  • Agaroz jel elektroforezi: 50 kb a kadar büyüklükteki nükleik asitlerin ayırt edilmesi

  • Pulse field Jel elektoforezi: 10 Mb a kadar büyüklükteki moleküllerin ayırımı


Page in kullan m alanlar

PAGE’in kullanım alanları

  • Araştırmalarda sıklıkla kullanılır

  • Protein ve nükleik asitlerin saflıklarının kontrolü

  • Oligonukleotit sekans analizi

  • Proteinlerin molekül ağırlıklarının ve izoelektrik pH larının belirlenmesi

  • Protein ve enzim eldesi

  • Western blotlama


Jel elektroforez sds page

PAGE

  • Poliakrilamit-matriks

  • Akrilamid- ana gövdeyi oluşturur

  • N,N metilen bisakrilamit- çapraz bağlanmalardan sorumludur

  • N,N,N’,N’tetrametiletilendiamin (TEMED)- katalizör

  • Amonyum persülfat (APS)- radikal oluşumu-polimerizasyonnun başlaması


Jel elektroforez sds page

  • SDS-PAGE- Proteinlerin denatüre edildikleri sistem

  • NATIVE PAGE- Proteinlerin denatüre edilmeden doğal halleriyle analiz edildikleri sistem


Proteinlerin denat rasyonu neden gereklidir

Proteinlerin denatürasyonu neden gereklidir?

  • Molekülün büyüklüğü ve üç boyutlu yapısı bulunduğu ortamdaki hareketini etkiler

  • Aynı büyüklükteki protein molekülünün ikincil, üçüncül ve dördüncül yapılarının kaldırılması aynı hızda hareketini sağlar

  • Deterjan kullanımı-Denatürasyon-SDS

    Hidrofobik etkileşimleri çözer, negatif yükü nedeniyle protein yapısına negatif yük katar


Jel elektroforez sds page

  • SDS yapısı

  • Proteinlerin üç boyutlu

    yapısını kırar

    Protein-lineer yapı ve

    negatif yük kazanır

SDS öncesi

Yüklü R grupları

Hidrofobik alanlar

SDS sonrası

Eğer proteinler denatüre edilip elektriksel ortama bırakılırsa proteinlerin hepsi aynı hızda,

büyüklüklerine bakılmaksızın pozitif kutba doğru hareket edeceklerdir


Sorun farkl b y kk kteki proteinleri ayn ortamda nas l farkl h zda y r tebiliriz

Sorun: Farklı büyükkükteki proteinleri aynı ortamda nasıl farklı hızda yürütebiliriz?

  • Poliakrilamit ortam

    Akrilamit/bisakrilamit: 19/1 maksimum çapraz bağlama

Polimerizasyon ve çapraz bağlanma. Akrilamit/bisakrilamit oranı ve her iki bileşenin toplam konsantrasyonu finalde ortaya çıkan jel matriksin por büyüklüğünü, ve katılığını etkiler. Bu ise yürüyecek proteinlerin hızını etkiler


Sds page

SDS-PAGE

  • Vakit alıcıdır

  • Oksijen varlığı polimerizasyonu engeller, bu sebeple cam plakalar arasına dökülür

  • Gözenek oluşumu kimyasal bir işlem olduğundan çok düzenli ve tek tip gözenek büyüklüğünde matriks oluşturulur

  • Gözenek büyüklüğü kullanılan akrilamid miktarı ile ters orantılıdır. 7% poliakrilait jel %12 lik olandan daha büyük gözenek içerir

  • Akrilamit nörotoksiktir

  • Polimerleşince tehlike arzetmez

  • Çok sayıda çapraz zincirler ve dallanmalar küçük moleküllerin daha hızlı hareketini sağlar


Kullan lan tampon

Kullanılan tampon

  • Yürütme tamponu

    Jel içerisinde ve elektroforez tankında istenilen değerde pH değerinin sabitlenmesini sağlar

    . Tris-glisin-SDS tamponu 0.025MTris,0.192MGlisin,%0.1SDS,pH8.3

    Bu tampon sistemi bir poliakrilamit matrikstemoleküler ağ etkisiyle denatüre protein-SDS kompleksini ayırır. Matrisin por büyüklüğü proteinlerin ayrılma etkinliğini belirler ve proteinlerin moleküler ağırlığına bağlıdır


Jel elektroforez sds page

  • Poliakrilamid jel birbirinden belli uzaklıkta (0,5-2,0 mm)tutulan iki cam tabaka arasında ve genelde 8-10 cm ya da 10-10 cm boyutunda hazırlanır.DNA dizileme çalışmalarında daha çok 20-40 cm boyutunda hazırlanır.

  • Polimerizasyon sırasında jelin üst kısmına yerleştirilen plastik bir tarak jelde küçük kuyucukların oluşumunu sağlar .Polimerizasyondan sonra tarak çıkarılır,kuyucuklar tuzları ve polimerize olmamış akrilamidi yok etmek üzere tamponla yıkanır.

  • Jel kaseti iki tampon arasına yerleştirilir;kuyucuklara örnekler konulur

    ve akım geçirilir.

  • Elektroforez bitiminde görüntüleme için jel uygun boya ile

    boyanır.


Jelin haz rlanmas ve d k m

Jelin hazırlanması ve dökümü

Kuyucuklar

İstifleme

jeli

Ayırma

(koşturma)

jeli

Tampon


Ko turma jeli tamponu 1 5mtris cl ph8 8

Koşturma jeli (tamponu 1.5MTris-Cl,pH8.8)

  • Toplam jelin ¾’ünü oluşturur

  • Elektroforez sırasında separasyonun sağlandığı kısım

  • Gözenekli bir yapıdadır

  • Jelde gözeneklerin büyüklüğü jeli oluşturmak için birbirlerine çapraz bağlarla bağlanan akrilamid monomerlerinin konsantrasyonu ile ilgilidir.

  • % Akrilamid & örnek moleküler ağırlığına göre belirlenir


Por b y kl ve akrilamid konsantrasyonuna g re proteinlerin ayr lmalar

Por büyüklüğü ve akrilamid konsantrasyonuna göre proteinlerin ayrılmaları


Stifleme y kleme jeli tamponu 0 5 m tris cl ph6 8

İstifleme (yükleme) jeli (tamponu 0.5 M Tris-Cl,pH6.8)

  • Separasyon jeli polimerleşince onun üzerine dökülür ve hemen ardından üzerine tarak yerleştirilerek örnek kuyucukları oluşturulur


Rnek haz rl ve jele y kleme

Örnek hazırlığı ve jele yükleme

  • Protein izolasyonu

  • Konsantrasyonunun belirlenmesi

  • Örneklerin denatürasyonu: örnek tamponu ile karıştırmak; 95 oC’de 5-10 dak. İnkübasyon

  • Yükleme (örnek tamponu) : 0.125M Tris, %4 SDS, %20 Gliserol, %10 β-merkaptoetanol, Bromophenol blue


Jel elektroforez sds page

Camların %70 lik alkol ve saf su ile temzilendikten sonra düzeneğe yerleştirilmesi ve jellerin dökülmesi tarağın yerleştirilmesi


Rne i denat re etme jeli tanka yerle tirme

Örneği denatüre etme, jeli tanka yerleştirme


Rnek y kleme d zene in tamamlanmas

Örnek yükleme, düzeneğin tamamlanması


Ko turma boyama y kama

Koşturma-boyama-yıkama


Jellerin boyanmas

Jellerin boyanması

  • Coomassie Blue boyama

    Coomassie R: Jel üzerinde yaklaşık 100 ng proteini tespit edebilir

    Coomassie G: 10 ng proteini tespit edebilir

  • Floresan boyalar

  • Spesifik, 1 ng dan daha az proteinleri tespit edebilir, nükleik asitleri boyamaz

  • Silver staining (gümüş boyama): Hassas bir teknik,

  • Proteinlerin jel matriksine tespiti, gümüş iyonlarının proteinlere bağlanması, formamid ileredüksiyon, görüntülme


Protein b y kl klerinin hesaplanmas

Protein büyüklüklerinin hesaplanması

Rf (hareket)


Protein b y kl klerinin hesaplanmas1

Protein büyüklüklerinin hesaplanması

  • Her bir Standart bandın ilerleme yolu yükleme boyasının gittiği yolun uzunluğuna bölünür: Rf değeri


Kaynak a

Kaynakça

  • B429 Moleküler Biyolojide temel teknikler uygulama klavuzu ( Doç Dr. Özlem Osmanağaoğlu, Araş. Gör. Fatma Kıran

  • http://www.tulane.edu/~wiser/methods/homework/HW5_key.pdf

  • http://radio.cuci.udg.mx/bch/EN/SDS.html

  • webgentech.org/uploads/protocol/tr/sds.pdf

  • tip.kocaeli.edu.tr/docs/tibbi.../laboratuvarIII.doc


  • Login