jel elektroforez sds page
Download
Skip this Video
Download Presentation
JEL ELEKTROFOREZİ SDS-PAGE

Loading in 2 Seconds...

play fullscreen
1 / 28

JEL ELEKTROFOREZİ SDS-PAGE - PowerPoint PPT Presentation


  • 641 Views
  • Uploaded on

JEL ELEKTROFOREZİ SDS-PAGE. FFMBG103. JEL ELEKTROFOREZİ. Büyüklük, yük ve konformasyon bakımından birbirlerinden farklılık gösteren yüklü makromolekülleri (protein, nükleik asit) iyonik bir ortamda birbirinden ayırtetmek için kullanılır.

loader
I am the owner, or an agent authorized to act on behalf of the owner, of the copyrighted work described.
capcha
Download Presentation

PowerPoint Slideshow about ' JEL ELEKTROFOREZİ SDS-PAGE' - isla


An Image/Link below is provided (as is) to download presentation

Download Policy: Content on the Website is provided to you AS IS for your information and personal use and may not be sold / licensed / shared on other websites without getting consent from its author.While downloading, if for some reason you are not able to download a presentation, the publisher may have deleted the file from their server.


- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - E N D - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -
Presentation Transcript
jel elektroforez
JEL ELEKTROFOREZİ
  • Büyüklük, yük ve konformasyon bakımından birbirlerinden farklılık gösteren yüklü makromolekülleri (protein, nükleik asit) iyonik bir ortamda birbirinden ayırtetmek için kullanılır.
  • Protein yada DNA/RNA elektriksel bir ortamda makromolekülün yükü ile doğru orantılı ancak şekli ve büyüklüğü ile ters orantılı bir hızda hareket ederler.
  • Aminoasit, peptit, nukleotit, nukleik asit; yüklü moleküller
  • Net yüke göre elektriksel ortamda hareket, ya pozitif (anot) ya da negatif (katot) kutuba
  • DNA/RNA fosfat grupları nedeni ile sabit – yüklü olup pozitif elektroda doğru hareket ederler
slide3

Bir partikülün göç oranını etkileyen faktörler

  • Elektriksel alan gücüne
  • Partikülün net yüküne
  • Elektroforez ortamının yoğunluğu
elektroforez tipleri
Elektroforez tipleri
  • Poliakrilamit jel elektroforezi (PAGE): proteinler ve DNA sekans analizinde 500 bç nin altındaki nükleik asitleri ayrılabilir
  • Native PAGE
  • Native Gradient PAGE
  • Urea PAGE
  • SDS PAGE
  • SDS Gradient PAGE
  • IEF
  • 2D PAGE
  • Western Blot
  • Agaroz jel elektroforezi: 50 kb a kadar büyüklükteki nükleik asitlerin ayırt edilmesi
  • Pulse field Jel elektoforezi: 10 Mb a kadar büyüklükteki moleküllerin ayırımı
page in kullan m alanlar
PAGE’in kullanım alanları
  • Araştırmalarda sıklıkla kullanılır
  • Protein ve nükleik asitlerin saflıklarının kontrolü
  • Oligonukleotit sekans analizi
  • Proteinlerin molekül ağırlıklarının ve izoelektrik pH larının belirlenmesi
  • Protein ve enzim eldesi
  • Western blotlama
slide6
PAGE
  • Poliakrilamit-matriks
  • Akrilamid- ana gövdeyi oluşturur
  • N,N metilen bisakrilamit- çapraz bağlanmalardan sorumludur
  • N,N,N’,N’tetrametiletilendiamin (TEMED)- katalizör
  • Amonyum persülfat (APS)- radikal oluşumu-polimerizasyonnun başlaması
slide7

SDS-PAGE- Proteinlerin denatüre edildikleri sistem

  • NATIVE PAGE- Proteinlerin denatüre edilmeden doğal halleriyle analiz edildikleri sistem
proteinlerin denat rasyonu neden gereklidir
Proteinlerin denatürasyonu neden gereklidir?
  • Molekülün büyüklüğü ve üç boyutlu yapısı bulunduğu ortamdaki hareketini etkiler
  • Aynı büyüklükteki protein molekülünün ikincil, üçüncül ve dördüncül yapılarının kaldırılması aynı hızda hareketini sağlar
  • Deterjan kullanımı-Denatürasyon-SDS

Hidrofobik etkileşimleri çözer, negatif yükü nedeniyle protein yapısına negatif yük katar

slide9

SDS yapısı

  • Proteinlerin üç boyutlu

yapısını kırar

Protein-lineer yapı ve

negatif yük kazanır

SDS öncesi

Yüklü R grupları

Hidrofobik alanlar

SDS sonrası

Eğer proteinler denatüre edilip elektriksel ortama bırakılırsa proteinlerin hepsi aynı hızda,

büyüklüklerine bakılmaksızın pozitif kutba doğru hareket edeceklerdir

sorun farkl b y kk kteki proteinleri ayn ortamda nas l farkl h zda y r tebiliriz
Sorun: Farklı büyükkükteki proteinleri aynı ortamda nasıl farklı hızda yürütebiliriz?
  • Poliakrilamit ortam

Akrilamit/bisakrilamit: 19/1 maksimum çapraz bağlama

Polimerizasyon ve çapraz bağlanma. Akrilamit/bisakrilamit oranı ve her iki bileşenin toplam konsantrasyonu finalde ortaya çıkan jel matriksin por büyüklüğünü, ve katılığını etkiler. Bu ise yürüyecek proteinlerin hızını etkiler

sds page
SDS-PAGE
  • Vakit alıcıdır
  • Oksijen varlığı polimerizasyonu engeller, bu sebeple cam plakalar arasına dökülür
  • Gözenek oluşumu kimyasal bir işlem olduğundan çok düzenli ve tek tip gözenek büyüklüğünde matriks oluşturulur
  • Gözenek büyüklüğü kullanılan akrilamid miktarı ile ters orantılıdır. 7% poliakrilait jel %12 lik olandan daha büyük gözenek içerir
  • Akrilamit nörotoksiktir
  • Polimerleşince tehlike arzetmez
  • Çok sayıda çapraz zincirler ve dallanmalar küçük moleküllerin daha hızlı hareketini sağlar
kullan lan tampon
Kullanılan tampon
  • Yürütme tamponu

Jel içerisinde ve elektroforez tankında istenilen değerde pH değerinin sabitlenmesini sağlar

. Tris-glisin-SDS tamponu 0.025MTris,0.192MGlisin,%0.1SDS,pH8.3

Bu tampon sistemi bir poliakrilamit matrikstemoleküler ağ etkisiyle denatüre protein-SDS kompleksini ayırır. Matrisin por büyüklüğü proteinlerin ayrılma etkinliğini belirler ve proteinlerin moleküler ağırlığına bağlıdır

slide13

Poliakrilamid jel birbirinden belli uzaklıkta (0,5-2,0 mm)tutulan iki cam tabaka arasında ve genelde 8-10 cm ya da 10-10 cm boyutunda hazırlanır.DNA dizileme çalışmalarında daha çok 20-40 cm boyutunda hazırlanır.

  • Polimerizasyon sırasında jelin üst kısmına yerleştirilen plastik bir tarak jelde küçük kuyucukların oluşumunu sağlar .Polimerizasyondan sonra tarak çıkarılır,kuyucuklar tuzları ve polimerize olmamış akrilamidi yok etmek üzere tamponla yıkanır.
  • Jel kaseti iki tampon arasına yerleştirilir;kuyucuklara örnekler konulur

ve akım geçirilir.

  • Elektroforez bitiminde görüntüleme için jel uygun boya ile

boyanır.

jelin haz rlanmas ve d k m
Jelin hazırlanması ve dökümü

Kuyucuklar

İstifleme

jeli

Ayırma

(koşturma)

jeli

Tampon

ko turma jeli tamponu 1 5mtris cl ph8 8
Koşturma jeli (tamponu 1.5MTris-Cl,pH8.8)
  • Toplam jelin ¾’ünü oluşturur
  • Elektroforez sırasında separasyonun sağlandığı kısım
  • Gözenekli bir yapıdadır
  • Jelde gözeneklerin büyüklüğü jeli oluşturmak için birbirlerine çapraz bağlarla bağlanan akrilamid monomerlerinin konsantrasyonu ile ilgilidir.
  • % Akrilamid & örnek moleküler ağırlığına göre belirlenir
stifleme y kleme jeli tamponu 0 5 m tris cl ph6 8
İstifleme (yükleme) jeli (tamponu 0.5 M Tris-Cl,pH6.8)
  • Separasyon jeli polimerleşince onun üzerine dökülür ve hemen ardından üzerine tarak yerleştirilerek örnek kuyucukları oluşturulur
rnek haz rl ve jele y kleme
Örnek hazırlığı ve jele yükleme
  • Protein izolasyonu
  • Konsantrasyonunun belirlenmesi
  • Örneklerin denatürasyonu: örnek tamponu ile karıştırmak; 95 oC’de 5-10 dak. İnkübasyon
  • Yükleme (örnek tamponu) : 0.125M Tris, %4 SDS, %20 Gliserol, %10 β-merkaptoetanol, Bromophenol blue
slide19
Camların %70 lik alkol ve saf su ile temzilendikten sonra düzeneğe yerleştirilmesi ve jellerin dökülmesi tarağın yerleştirilmesi
jellerin boyanmas
Jellerin boyanması
  • Coomassie Blue boyama

Coomassie R: Jel üzerinde yaklaşık 100 ng proteini tespit edebilir

Coomassie G: 10 ng proteini tespit edebilir

  • Floresan boyalar
  • Spesifik, 1 ng dan daha az proteinleri tespit edebilir, nükleik asitleri boyamaz
  • Silver staining (gümüş boyama): Hassas bir teknik,
  • Proteinlerin jel matriksine tespiti, gümüş iyonlarının proteinlere bağlanması, formamid ileredüksiyon, görüntülme
protein b y kl klerinin hesaplanmas1
Protein büyüklüklerinin hesaplanması
  • Her bir Standart bandın ilerleme yolu yükleme boyasının gittiği yolun uzunluğuna bölünür: Rf değeri
kaynak a
Kaynakça
  • B429 Moleküler Biyolojide temel teknikler uygulama klavuzu ( Doç Dr. Özlem Osmanağaoğlu, Araş. Gör. Fatma Kıran
  • http://www.tulane.edu/~wiser/methods/homework/HW5_key.pdf
  • http://radio.cuci.udg.mx/bch/EN/SDS.html
  • webgentech.org/uploads/protocol/tr/sds.pdf
  • tip.kocaeli.edu.tr/docs/tibbi.../laboratuvarIII.doc
ad