ELEKTROFORETIK Y NTEMLER

1. ELEKTROFORETIK Y�NTEMLER MEHMET FUAT G�LHAN 2010

2. ELEKTROFOREZ NEDIR? - Elektroforez genel anlamda, �zel bir sivi ortamda, par�aciklarin i�erdikleri elektriksel y�ke g�re farkli hizda ve farkli y�nde hareket etmesi sonucu, b�t�n bir maddenin yapisindaki farkli maddelerin ayirt edilebilmesini saglayan bir inceleme y�ntemidir. - Ilk kez 1937 yilinda Arne tiselius tarafindan gelistirilmis olan elektroforezden, �zellikle tipta ve biyokimyada, kandaki �esitli protein ve lipitlerin ayrilmasi, taninmasi ve miktarinin �l��lmesinde yararlanilir. Ayrica elektroforezden sanayide yaygin bi�imde yararlanilmaktadir.

3.  �ALISMA PRENSIBI - Elektroforezin �alisma ilkesi; molek�l agirligi ve molek�lde bulunan elektrik enerjisinin jel i�inden bir y�kten digerine giderken kat ettigi mesafe farkliliklarini ele almaktir. Bu farkliliklara g�re enzim ya da proteinin birbirinden farki anlasabilir. - Anyonlar anoda, katyonlar katoda hareket ederler. Molek�llerin elektroforezdeki hizini etkileyen �esitli fakt�rlerde vardir.

5. Elektroforez i�in d�rt seye ihtiya� vardir: -Iyonlarin hareket edebilecegi uygun bir destek ortami (kagit,sel�loz asetat,nisasta,agaroz jeli ya da poliakrilamit) -Elektriksel alani olusturmak i�in dogru akim saglayacak g�� kaynagi -Uygun pH�da bir tampon ��zelti -Birbirinden ayrilan bantlari kantitatif olarak degerlendirebilen dansitometre.

6. G�� KAYNAGI - Elektrotlar arasinda elektrik akimi saglar. - G�� hizinin artmasi, - Ayirt edilen molek�llerin buharlasmasi, - Su kaybi, - Iyon konsantrasyonunun artmasi, - Tampon viskozitesinde azalma direncinin d�smesi, - Bu problemleri en aza indirmek i�in: sabit akimli g�� kaynagi kullanilmalidir.

7. Tamponlar - Elektrik akimini tasimak - Elektroforezin y�r�t�ld�gu pH�yi belirlemek - Y�r�t�len molek�lun elektriksel y�k�n� belirlemek Tamponun iyonik g�c� ise ; - Iyonik bulutun kalinlasmasi - Migrasyon orani - Elektroforetik zonlarin daha keskin ayrilmasi - Molek�llerin hareket etmesinde �nemlidir. - Barbital tamponlar & Tris-borik asid- - EDTA tamponlari en iyi bilinen tamponlardir.

8. BOYAMA - Elektroforez tamamlandiktan sonra destek ortami bir boya ile muamele edilerek ayrilmis fraksiyonlarin identifikasyonu saglanir. -Numune tarafindan alinan boyanin miktari ; - proteinin tipine - sabitleyici ajanlarin olusturdugu denat�rasyon derecesine baglidir. En iyi bilinen boyalar ;

9. Elektroforetik Mobilite (U) Alana uygulanan g�� basina g�� hizidir. iki denklemden t�retilmistir; 1 .Elektrik alanin iyon �zerine olusturdugu hareket g�c� Fe = qE : q net yuk, E ise elektrik alan g�c� 2. Buna zit olarak destek ortamin s�rt�nme direnci sonucu olusan hareketi engelleyici g��t�r Fs = fv : f s�rt�nme g�c� , v hiz 3. qE = fv 4. Sonu� olarak, Elektroforetik mobilite (U) = v/E = q/f = q/6p?r : ? destek ortamin viskozitesi, r molek�l�n �api

10. Bu form�le g�re, elektroforetik mobilite net y�k ile dogru ;molek�l b�y�kl�g� ve elektroforetik ortamin viskozitesi ileters orantilidir.

11. Elektroforezde G�� Hizi - Molek�l�n net elektriksel y�k�ne - Molek�l�n yapisi ve b�y�kl�g�ne - Elektriksel alanin g�c�ne - Destek ortamin �zelligine - Uygulama isisina baglidir

12. Elektroforezin genel prosed�r� a.Uygulama b.Y�r�tme c.Boyama d.Temizleme e. Seffaflastirma f. Degerlendirme

13. Uygulama ve y�r�tme: Teknige,s�reye ve analizin �esidine g�re degisebilir. Boyama: Sadece incelenecek maddeyi boyayan boyalar kullanilir. Temizleme: Normalde destek ortami boya i�ine kondugunda tamamen boyanir.Ancak biz sadece incelenecek kismin boyali kalmasini isteriz. Bu nedenle de destek ortami belli bir temizleme sivisinda bir s�re tutulur. (% 5 asetik asit) Seffaflastirma: Dansitometre de okuma yapilabilmesi i�in destek ortaminin seffaf olmasi gerekir.Bunun i�in %30-40 dimetil s�lfoksit veya diger seffaflastiricilar kullanilabilir. Degerlendirme: Dansitometre de yapilir.

14. Elektroforez �esitleri -��������K�git elektroforezi -�������� Sel�loz asetat elektroforezi -�������� Jel elektroforezi - a)Agaroz jel elektroforezi -������b)Poliakrilamid jel elektroforezi (PAGE) -�������� SDS-poliakrilamid jel elektroforezi -�������� Kapiller elektroforez - Imm�noelektroforez - Nisasta jeli elektroforezi

15. Kagit elektroforezi - Hem rutin hem de arastirma maksatli olarak kullanilabilir. Destek ortami olarak kaliteli filtre kagidi kullanilir. Metodun avantaji, ucuz ve y�ksek gerilime dayanabilmesidir. Ancak deney s�resi uzun oldugundan rutinde pek kullanilmaz. �zellikle aminoasitlerin ayriminda kullanilir.

16. Sel�loz asetat elektroforezi Sel�lozun hidroksil gruplari, asetik anhidrit ile reaksiyona sokulursa sel�loz asetat elde edilir. Avantajlari: Hem elektroforez s�resi kisa (30-0 dk) hemde deney bittikten sonra numuneleri uzun s�re korumak m�mk�n oldugundan rutinde sik kullanilir. Dezavantajlari: Rezol�syon jeldeki kadar iyi degildir. En �nemli dezavantaji da standardizasyonu iyi degildir. Ayni firmaca �retilen ayni parti i�inde bile farkliliklar g�r�lebilir.

17. Agaroz jel elektroforezi - Destek maddesi olarak bir karbonhidrat polimeri olan agaroz veya agaropektin kullanilir. Bu maddelerin proteinlere affinitesi az oldugundan protein bantlari birbirinden daha iyi ayrilir. Ayrica �ok iyi seffaflastiklari i�in dansitometrik degerlendirmeleri daha g�venilirdir. Bu nedenle rutin uygulamalarda sik�a kullanilmaktadir. Deney s�reside olduk�a kisadir (30-90 dk.) - Serum proteinleri, n�kleik asitler, hemoglobin varyantlari, laktat dehidrogenaz ve kreatin kinaz izoenzimleri, lipoprotein fraksiyonlari ve diger bazi maddelerin analizlerinde basari ile kullanilmaktadir.

19. Nisasta jeli elektroforezi - Destek materyali olarak nisasta kullanilir. Nisasta jel elektroforezi hem y�zey y�k�, hem de molek�l b�y�kl�g�ne bagli olarak ayirt edilen makromolek�ler iyonlarin �zelliklerinin anlasilmasina izin verir. Dogal nisasta jellesmediginden kismen hidrolize olarak kullanilir. - Agaroz jelde oldugu gibi, nisasta jelde de islem horizontal olarak ger�eklestirilebilir.

20. Poliakrilamid jeli elektroforezi -Poliakrilamid jel elektroforezinde 20 yada daha fazla fraksiyon elde edilir. -Bu nedenle genetik varyantlar ve izoenzim analizleri olmak �zere, protein ve n�kleik asit �alismalarinda tercih edilir. -Separasyon; molek�llerin b�y�kl�g�ne ve y�k�ne baglidir.

21. -Ayrilan protein zonlarinin diskoid seklinden dolayi bu metod bazen disk elektroforezi olarak da tanimlanmaktadir. Avantajlari: -Termostabil, saydam, kimyasal olarak inerttir. - Genis por b�y�kl�g�ne sahiptir. Y�ks�zd�r. Dezavantaji: Kanserojeniktir.

22. SDS-poliakrilamid jel elektroforezi - Bu elektroforez tipinde �-mercaptoethanol kullanilir ama� disulfid k�pr�lerini indirgemektir. - �-mercaptoethanol & SDS, numune ile 5 dakika kaynatilir. - SDS: Kuvvetli deterjan etki ile proteinleri denat�re eder. SDS proteinlerin y�zeyini kaplar ve proteinlerin hidrofobik b�lgelerine baglanir . - Separasyon molek�ler b�y�kl�ge g�re ger�eklesir. - Genellikle proteinlerin molek�l agirligi ve proteinlerin saflik tayininde kullanilir.

24.  Kapiller elektroforez - Sistem ters cevrilmis �U� seklinde duran ve uclari tampon dolu tuplere batmis durumda iken y�ksek gerilim uygulanan bir borudan olusur. - Dis y�zeyi; ya bir sivi kilifi yada soguk hava akimi ile sogutularak isinma sorunu ortadan tamamen kalkar. - �ok kirilgan olan bu kapillerin kirilmasini �nlemek icin �zeri poliimid tabakasi ile kaplanmistir. - Poliimid tabakasinin detektor �nune gelen kismi ya soyularak yada yakilarak bir pencere a�ilir. - Bu pencere, spektrofotometre kuveti g�revi g�r�r. - Elektroforezle ayrilan molek�ller bu pencereden ge�erken isigi absorbe ederler. - Absorbe edilen isik detekt�r tarafindan saptanir. - Bilgisayar sistemi araciligi ile absorbsiyon pikleri ekrana verilir .

26. Imm�noelektroforez - Ilk kez 1953 yilinda Grabar ve Williams isimli iki bilim adami, jel elektroforezi sonrasi imm�n diff�zyon uygulamislardir. Imm�nelektroforez ile bir �ok spesifik protein g�sterilebilir: Prealbumin, albumin, a1- asit glukoprotein, a1-antitripsin, tiroid baglayan globulin, a1-kimotripsin, a2-HS glukoprotein, a2-makroglobulin, seruloplazmin, haptoglobin, antitrombin III, C1 esteraz inhibit�r�, hemopeksin, � lipoprotein, transferrin, C3, C4, C5, properdin fakt�r B, plazminojen, IgA, IgM, IgG. - Bu y�ntem bu g�n klinik laboratuarlarda, imm�nglobulinlerin g�sterilmesinde yaygin olarak kullanilmaktadir. Immunelektroforez i�in agaroz jel kullanilir. Bu y�ntemin prensibi; serum proteinlerinin elektroforetik ayrimindan sonra, aranan proteine karsi antiserum ekleyerek antijen-antikor presipitatlarinin g�sterilmesidir.

27. Diger elektroforez y�ntemleri - iki y�nl� Jel Elektroforez - Izoelektrik Odaklanma - O�Farrell Metodu - Pulse Field Jel Elektroforez (PFGE) - Preparative Gel electroforezi - Protein Elektroforezi - Serum Protein Elektroforez - Hemoglobin Elektroforezi - Lipoprotein Elektroforezi

28. Kullanim yerleri � Saflastirma � Saflik kontrol� � Molek�l agirligi saptama � Kalitsal veya kalitsal olmayan hastaliklarin belirlenmesi � Enzim izozimlerinin saptanmasi (tanisal ama�li, populasyon �alismasi i�in,adli tipta) � Imm�nolojik ve molek�ler biyoloji

29. THE END