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蛋白质双向电泳及质谱技术

蛋白质双向电泳及质谱技术. 大连理工大学 refine. 蛋白质双向电泳技术. 双向电泳简介. 2-DE 是目前唯一种可以仅通过一次操作解析上千种蛋白质的技术 。 第一向 — 等点聚焦 (IEF) pH 梯度载体 pI 第二向 — 十二烷基硫酸钠 -PAGE(SDS-PAGE) SDS 作为变性剂和助溶剂 分子量. pH 9 - pH 3 +. 聚丙烯酰胺. 双向电泳的基本原理与流程示意. 两性电解质. 样品. 等点聚焦 ( 第一向 ). 第二向. 分子量. SDS-PAGE. pH 梯度 (pI).

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蛋白质双向电泳及质谱技术

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  1. 蛋白质双向电泳及质谱技术 大连理工大学 refine

  2. 蛋白质双向电泳技术

  3. 双向电泳简介 • 2-DE是目前唯一种可以仅通过一次操作解析上千种蛋白质的技术 。 • 第一向—等点聚焦(IEF) • pH梯度载体 • pI • 第二向—十二烷基硫酸钠-PAGE(SDS-PAGE) • SDS作为变性剂和助溶剂 • 分子量

  4. pH 9 - pH 3 + 聚丙烯酰胺 双向电泳的基本原理与流程示意 两性电解质 样品 等点聚焦 (第一向) 第二向 分子量 SDS-PAGE pH 梯度(pI)

  5. 双向电泳具体步骤 • 样品制备 • 缓冲液的配制 • IPG条重泡涨及上样 • 第一向：IEF • IPG条平衡 • 平衡缓冲液Ⅰ(还原) • 平衡缓冲液Ⅱ(巯烷基化) • 第二向：SDS-PAGE • 胶条染色 • 成像及图像分析

  6. 为什么要进行样品制备 ？ • 目前双向电泳一般只能分辨到1000-3000个蛋白质点(spot)，而样品中的蛋白种类可达到10万种以上。 • 待研究样本(如临床样本)常是各种细胞和组织混杂，而蛋白质组研究的通常是单一的细胞类型。

  7. 样品制备原则 1 保证样品蛋白质完全溶解，分级效果好，干扰因素少 • 尽量使所有待分析的蛋白样品全部处于溶解状态（包括多数疏水性蛋白）。 • 避免样品制备过程中发生样品的抽提后化学修饰（如酶性或化学性降解等）。 • 完全去除样品中的核酸和某些干扰蛋白。 • 尽量去除起干扰作用的高丰度或无关蛋白，从而保证待研究蛋白的可检测性。 • 通过超离心去除所有颗粒状物质，防止其堵塞凝胶孔路。 2 最大限度减少样品的损失 • 低温保存样品(一般需低于-86℃) • 尽量缩短处理时间 • 除盐，省略不必要的过程 • 保证样品在聚焦时不发生蛋白的聚集和沉淀。

  8. 样品制备流程及注意事项 预处理 (清洗等) 破碎 沉淀 富集 按溶解度分级 溶解 除杂

  9. 样品的破碎 • 原则－最小限度的减少蛋白水解和其它形式的蛋白降解 • 样品的来源 • 易碎的细胞 • 坚硬的组织 • 植物细胞 • 真菌 温和 方法 剧烈

  10. 温和破碎法 • 渗透压冲击(培养的细胞) • 低渗液中的悬浮细胞 • 反复冻融法(细菌) • 液氮冷冻 • 去污剂降解(酵母、霉菌) • 降解缓冲液(含尿素和去污剂) • SDS(应在IEF前去除) • 酶降解(植物、细菌、真菌) • 溶菌酶(细菌) • 纤维素酶，果胶酶(植物) • 溶壁酶(酵母)

  11. 剧烈破碎法 • 超声破碎(细胞悬浮液) • 需以冰冷却避免过热 • 弗式细胞压碎器(French pressure cell，带壁微生物 • 细胞在剪切力作用下破碎 • 研磨(固体组织，微生物) • 液氮中将固体组织磨成细粉末 • 样品研磨器(用于少量样品的处理) • 用于精确样品 • 珠磨法(胞悬液，微生物) • 通过磨珠研磨破坏细胞壁

  12. 作用 去除杂质 浓缩样品 抑制蛋白酶活性 关键-可溶性 获得可以重新溶解的蛋白 常用方法 硫酸铵沉淀 TCA沉淀 丙酮沉淀 TCA/丙酮沉淀 醋酸铵/甲醇/苯酚抽提 对于疏水性特别强的蛋白如膜蛋白 硫脲 SDS 新型两性表面活性剂(如磺基甜菜碱) 样品的沉淀

  13. 样品中杂质的去除 • 去除原则 • 尽量不丢失蛋白 • 减少蛋白的修饰 • 杂质的主要种类 • DNA/RNA • 脂质 • 多糖盐 • 离子去污剂 • 其他固体杂质

  14. DNA/RNA的去除 • 样品中含核酸的不利影响 • 能被银染色法染色 • 在凝胶酸性部分产生水平条纹 • 当样品到达IEF凝胶酸性端时，与蛋白质一同沉淀 • 去除方法 • 蛋白沉淀法 • DNase/RNase处理 • 超声(机械破坏)、超高速离心 • DNA/RNA抽提(苯酚/氯仿)

  15. 其他杂质的去除 • 脂质 • 使蛋白质不易溶解且会影响其分子量及pI • 丙酮沉淀 • 多糖 • 阻塞胶体，影响蛋白质沉淀、聚焦 • TCA、硫酸铵或醋酸铵/甲苯/苯酚沉淀；超速离心和高pH • 盐 • 使胶条导电能力增强，共聚焦不易发生 • 透析；胶体过滤；沉淀或重新悬浮 • 离子去污剂 • 如SDS，使蛋白质带负电不能聚焦 • 丙酮沉淀；将含SDS的蛋白溶于含两性或非离子去污剂如CHAPS，Triton X-100，NP-40等的缓冲液中并使SDS终浓度＜0.25% • 固体杂质 • 阻塞胶体，影响蛋白质沉淀、聚焦 • 过滤

  16. 样品的溶解 • 2-DE成功分离蛋白质的最关键因素之一 • 溶解的目标 • 样品中非共价结合的蛋白质复合物和聚积体完全破坏，从而形成各个多肽的溶解液（否则样品中结合牢固的蛋白复合物可能使2-DE中出现新的蛋白点，相应的表示单个多肽的点的强度会下降） • 溶解方法必须允许可能干扰2-DE分离的盐、脂类、多糖和核酸等物质的去除 • 溶解方法要保证样品在电泳过程中保持溶解状态

  17. 增加样品溶解性的手段 • 变性剂 • 改变氢键结构，使蛋白疏水中心暴露伸展 • 尿素、硫尿 • 表面活性剂 • 溶解疏水基团 • 离子去污剂SDS、非离子去污剂Triton X-100和NP-40、两性离子去污剂CHAPS等 • 还原剂 • 使变性蛋白进一步伸展溶解 • 含自由巯基的DTT或-巯基乙醇，不带电荷的磷酸三丁酯(TPB) • 起载体作用的两性电解质 • 到达平衡位置形成pH梯度，“运载”电流、pH • 捕获样品中少量盐分 • 浓度应小于0.2％（w/v，浓度过高会使IEF的速度降低)

  18. 试剂 用量 24g 尿素加入 25mL H2O 8M 尿素 385mg DTT或 500uL 200mM TBP原液 50mM DTT 或2mM TBP 2g 4% CHAPS 0.2%两性电解质载体 见下表 0.0002%溴酚蓝 100uL 0.1% 原液 ddH2O 定容至50mL 样品液的准备 标准液：

  19. IPG 胶pH 范围 样品溶液体积 (/5ml) 样品溶液体积 (/5ml) 两亲性电解液浓度(w/v) 两亲性电解液范围 3-10 3-10 40% 25l 250  l 4-7 4-6 40% 12.5  l 125  l 5-7 40% 12.5  l 125  l 3-6 3-5 40% 25  l 250  l 4-6 40% 12.5  l 125  l 5-8 5-8 40% 25  l 250  l 7-10 7-9 40% 12.5  l 125  l 8-10 20% 25  l 250  l IPG用两亲性电解液的组成

  20. 样品制备注意事项 • 蛋白质水解 • 低温 • Tris碱，碳酸钠或碱性载体两性电解质 • 蛋白抑制剂 • 特殊样品的制备 • 低丰度蛋白的分离 • 预分级 • 窄pH胶(<2个pH单位) • 强碱性蛋白(如核糖体)的处理 • 预处理富集 • 特殊pH梯度的IPG胶条（如pH3－12、4-12或10-12）进行等电聚焦 • 极端分子量蛋白的处理 • 小于8kD 对流混合，产生绒毛状或模糊的带 • 大于200kD的蛋白，变性为多肽

  21. 酸 碱 固定pH梯度(Immobilized pH Gradient, IPG)胶条的制备 梯度器 A D 塑料支持膜 B E C F pH 3 pH 10

  22. 酸缓冲基团： CH2 = CH-C-NH-R 碱缓冲基团： NH3+ O 固定pH 梯度(IPG)示意图 丙烯酰胺单体 COO- R 聚丙烯酰胺凝胶

  23. 宽pH梯度及窄pH梯度 • 宽pH梯度用于： 全部蛋白(确定感兴趣蛋白的大致位置) • 窄pH梯度用于： 提高分辨率 增加载样能力以检测、分析更多蛋白

  24. IPG 胶的重泡涨及上样 重泡涨溶液： 8M 尿素 2% NP-40 或CHAPS 2% IPG缓冲液(两亲性电解液) 0.28% DTT 微量溴酚蓝 2-DE 样品 重泡涨溶液 IPG 胶条支架 IPG胶条 定位 泡涨目的：使样品能完全以可溶形式进入IPG胶条内

  25. 蛋白载样量 IPG胶条对蛋白载样量的影响因素： • 待分析的蛋白点的量应满足随后的质谱分析待研究蛋白的丰度 • 样品的复杂度 • 复杂度较高的样品，为了尽可能的了解所包含的每种蛋白，需要反复实验才能完成。如果将待检样品被富集以后则更易分析。 • IPG胶条的pH范围 • 预试验确定 • 先宽后窄 • 先线性后非线性 • 先短后长

  26. 支架盖 IPG胶条 电极 电压 时间 第一向：等点聚焦 电极垫 1. 放置电极垫(?) 2. 200 V 维持 1.5h 3. 500 V 维持 1.5h 4. 1000 V 梯度上升1500vh 5. 8000 V 梯度上升(?) 36000vh

  27. IPG胶条的平衡 • 平衡液 • 6 M 尿素和30% 甘油 • 减少电内渗 • 第一步平衡 • 加DTT • 使变性的非烷基化蛋白处于还原状态 • 第二步平衡 • 加碘乙酰胺 • 使蛋白质巯烷基化，防止其在电泳过程中重新氧化

  28. SDS SDS-PAGE SDS-PAGE 使被分离的蛋白质与SDS完整结合 • 第二向: SDS-PAGE • SDS 平衡 • SDS-PAGE SDS 平衡液 50 mM Tris-HCl 6 M 尿素 30% 丙三醇 2% SDS 微量溴酚蓝 IPG 胶条 向电泳缓冲液中加 0.5%的琼脂糖 标记纸片 SDS-PAGE

  29. 染色方法 • 胶体考马斯亮蓝染色 • 灵敏度为30~100ng，线性范围是20倍 • 可实现PAGE的无背景染色 • 会对蛋白质进行修饰而影响质谱分析的结果 • 胺基黑染色 • 转印至聚偏二氟乙烯（PVDF）上的蛋白质的染色 • 转印至硝酸纤维素膜上的蛋白质的染色 • 银染 • 可减少胶内蛋白质产量 • 对某些种类的蛋白质染色效果差 • 对其后的蛋白质测序和质谱分析造成影响

  30. 银染色 50% 甲醇 25% 乙酸 4h ddH2O 30 sec ddH2O 洗3次 30min/次 3% Na2CO3 0.0185% 甲醛 0.004% DTT 溶液 30min 2.3M 柠檬酸 0.1% AgNO3 30min 5% 乙酸 25% 甲醇

  31. 染色方法 • 负染 • 主要包括金属盐染料、锌－咪唑染料等的使用 • 能专门提高PAGE胶上蛋白质的回收率 • 速度快（5~15min）且能保持蛋白质的生物活性 • 不能用于膜上染色 • 适用于蛋白质显色、完整蛋白质的胶上被动提取以及质谱分析 • 胶体扩散染料 • 主要包括印度墨水染料、胶体金属染料等 • 高灵敏度检出电转印至硝酸纤维素和PVDF膜上的蛋白质 • 灵敏度与PAGE胶内的银染类似 • 不用于胶内染色

  32. 染色方法 • 有机荧光团染料 • 包括共价结合和非共价结合的荧光团染料两类，后者最为常用，其典型代表是已经商品化的SYPRO Red、 Orange、 Ruby等荧光染料 • 可对SDS-PAGE胶内蛋白质进行一步染色，约30~60min完成 • 灵敏度为2~10ng其线性范围为3个数量级 • 在Tris/甘氨酸转印缓冲液中染色后，蛋白质可被转印至膜上并进行免疫染色或Edman测序来鉴定蛋白质 • 金属螯合染料 • 与现代蛋白质组学研究相兼容的 • 专门与常用微量化学表征过程兼容 • 不包含戊二醛、甲醛或Tween-20等，很容易和集成化蛋白质组学平台（包括自动化凝胶染色仪、图像分析工作站、机器人剪切仪器、蛋白质酶解工作站和质谱仪等）相结合

  33. 2-DE 分离的可溶性E. coli 蛋白 凝胶的图像处理分析 典型流程 • 凝胶图像的扫描 • 图像加工 • 斑点检测和定量 • 凝胶配比 • 数据分析 • 数据呈递和解释 • 2-DE数据库的建立

  34. 目前双向电泳需解决的问题 • 样品的制备及溶解 • 不溶性蛋白(膜蛋白及核内蛋白) • 难分离蛋白(如毛发及皮肤中的蛋白) • 载样量的提高 • 初步分离 • 低丰度蛋白、碱性蛋白及大分子量蛋白 • 定量分析 • 灵敏度及可重复性

  35. 对于双向电泳的建议 • 首先采用宽pH范围的胶条，确定蛋白的分布范围，通常采用pH3-10的胶条 • 如果pH线性分布的胶条分离效果不好，可采用非线性胶条 • 加大蛋白上样量，提高局部蛋白的分辨率 • 采用窄pH范围的胶条，提高某pH范围蛋白的分辨率 • 第二向采用梯度胶进行分离 • 去除高丰度蛋白，进行蛋白的分级处理，富集低丰度蛋白

  36. 蛋白质质谱技术

  37. 质谱基础 检测 质量分选(过滤) 电离 离子检测器 离子源 质量分析器 形成离子 (带电分子) 根据m/z分选离子 检测离子 基本步骤: 1. 样品离子化 2. 根据质量(m/z)不同分离离子 3. 检测每种质量离子的数目 4. 收集、处理数据得到质谱图 样品 • 固体 • 液体 • 蒸汽 数据处理 质谱

  38. 质谱的评价指标 • 质量范围 • 速度 • 灵敏度 • 分辨率 • 精确度

  39. MH+ MH+ 相对强度 MH+ m/z • 特点： • 灵敏度高 • 准确度高 • 分辨率高 激光 • 质量范围广 • 图谱简明 • 速度快 样品探针 基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS) 335 nm + + + 自由漂移区 检测器

  40. 串联质谱法 (MS/MS) 碰撞气体 TOF质量分析器 ESI-Q-TOF 质谱仪 MCP 检测器 ESI 四级杆质量分析器 步骤： 1质量分析 2碰撞(离子裂解) 3质量分析 反射器 碰撞室

  41. 串联质谱的优点 • 强的抗背景干扰能力 • 极高的检测灵敏度和准确度 • 可用来分析复杂混合物中的蛋白质 • 丰富的检测信息，高通量鉴别蛋白质

  42. 1、鉴定和注释蛋白质的路线 • 通过肽质谱指纹图（peptide mass fingerprinting，PMF）和数据库搜寻匹配 • 通过串联质谱进行单个或多个蛋白质的鉴定 • 鸟枪法蛋白质组学

  43. MALDI-TOF检测的多肽指纹 凝胶 数据库 蛋白质 ? 1 2 3 胰酶消化 多肽 已测得质 谱数据或理论 质谱 数据 质谱 3235.2256 1234.5396 783.9147 375.2561 比较: ?? 是否相同??

  44. 肽质谱指纹图在数据库中匹配不成功的可能原因肽质谱指纹图在数据库中匹配不成功的可能原因 • 样品量太少，PMF图信噪比太低，输入库中搜寻的数据质量不好。 • 2-DE胶上所取的一个蛋白质点并非单一蛋白质，所获PMF图实际上是两个以上蛋白质的混合图。

  45. 续： • 操作中角蛋白或其他蛋白质的污染 • 蛋白质发生了较多的转译后修饰，数据库中未有记载 • 所用胰蛋白酶质量不够好，蛋白酶自酶解片段多 • 未知的新蛋白质 • 数据库规模太小

  46. 串联质谱鉴定多肽的计量方法 蛋白质数据库 ？查询 ① 输入 输出 串联质谱图 序列片段 PNT 氨基酸序列 VLDPNTVFAL ③ ② 从头测序

  47. 联合技术精确鉴定蛋白质 • 组织切片或印片原位质谱分析技术 • 两级飞行时间串联质谱（MALDI-TOF/TOF） • 傅里叶转换回旋共振质谱（FTMS） • 表面增强激光解吸/电离飞行时间质谱（SELDI-TOF-MS）

  48. 2、基于生物质谱的定量蛋白质组研究策略 原理：对于具有相同离子化能力的蛋白质或多肽，可以通过比较质谱峰的强度（或峰面积）得到待比较蛋白质的相对量。

  49. 3、基于质谱的蛋白质相互作用研究方法 • 靶蛋白制备 • 蛋白质复合体的纯化 • 蛋白质复合体的质谱鉴定 基本步骤：

  50. (1)亲和层析耦联质谱技术 • 基本原理：将某种蛋白质以共价键固定在基质（如琼脂糖）上，含有与之相互作用的蛋白质的细胞裂解液过柱，先用低盐溶液洗脱下未结合的蛋白质，然后用高盐溶液或SDS溶液洗脱结合在柱子上的蛋白质，最后用多维液相色谱耦联质谱技术（MDLC-ESI-MS/MS）鉴定靶蛋白的结合蛋白。

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