蛋白质双向电泳及质谱技术
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蛋白质双向电泳及质谱技术. 大连理工大学 refine. 蛋白质双向电泳技术. 双向电泳简介. 2-DE 是目前唯一种可以仅通过一次操作解析上千种蛋白质的技术 。 第一向 — 等点聚焦 (IEF) pH 梯度载体 pI 第二向 — 十二烷基硫酸钠 -PAGE(SDS-PAGE) SDS 作为变性剂和助溶剂 分子量. pH 9 - pH 3 +. 聚丙烯酰胺. 双向电泳的基本原理与流程示意. 两性电解质. 样品. 等点聚焦 ( 第一向 ). 第二向. 分子量. SDS-PAGE. pH 梯度 (pI).

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蛋白质双向电泳及质谱技术

大连理工大学

refine



双向电泳简介

  • 2-DE是目前唯一种可以仅通过一次操作解析上千种蛋白质的技术 。

  • 第一向—等点聚焦(IEF)

    • pH梯度载体

    • pI

  • 第二向—十二烷基硫酸钠-PAGE(SDS-PAGE)

    • SDS作为变性剂和助溶剂

    • 分子量


pH 9 -

pH 3 +

聚丙烯酰胺

双向电泳的基本原理与流程示意

两性电解质

样品

等点聚焦

(第一向)

第二向

分子量

SDS-PAGE

pH 梯度(pI)


双向电泳具体步骤

  • 样品制备

    • 缓冲液的配制

  • IPG条重泡涨及上样

  • 第一向:IEF

  • IPG条平衡

    • 平衡缓冲液Ⅰ(还原)

    • 平衡缓冲液Ⅱ(巯烷基化)

  • 第二向:SDS-PAGE

  • 胶条染色

  • 成像及图像分析


为什么要进行样品制备

  • 目前双向电泳一般只能分辨到1000-3000个蛋白质点(spot),而样品中的蛋白种类可达到10万种以上。

  • 待研究样本(如临床样本)常是各种细胞和组织混杂,而蛋白质组研究的通常是单一的细胞类型。


样品制备原则

1 保证样品蛋白质完全溶解,分级效果好,干扰因素少

  • 尽量使所有待分析的蛋白样品全部处于溶解状态(包括多数疏水性蛋白)。

  • 避免样品制备过程中发生样品的抽提后化学修饰(如酶性或化学性降解等)。

  • 完全去除样品中的核酸和某些干扰蛋白。

  • 尽量去除起干扰作用的高丰度或无关蛋白,从而保证待研究蛋白的可检测性。

  • 通过超离心去除所有颗粒状物质,防止其堵塞凝胶孔路。

    2 最大限度减少样品的损失

  • 低温保存样品(一般需低于-86℃)

  • 尽量缩短处理时间

  • 除盐,省略不必要的过程

  • 保证样品在聚焦时不发生蛋白的聚集和沉淀。


样品制备流程及注意事项

预处理

(清洗等)

破碎

沉淀

富集

按溶解度分级

溶解

除杂


样品的破碎

  • 原则-最小限度的减少蛋白水解和其它形式的蛋白降解

  • 样品的来源

    • 易碎的细胞

    • 坚硬的组织

    • 植物细胞

    • 真菌

温和

方法

剧烈


温和破碎法

  • 渗透压冲击(培养的细胞)

    • 低渗液中的悬浮细胞

  • 反复冻融法(细菌)

    • 液氮冷冻

  • 去污剂降解(酵母、霉菌)

    • 降解缓冲液(含尿素和去污剂)

    • SDS(应在IEF前去除)

  • 酶降解(植物、细菌、真菌)

    • 溶菌酶(细菌)

    • 纤维素酶,果胶酶(植物)

    • 溶壁酶(酵母)


剧烈破碎法

  • 超声破碎(细胞悬浮液)

    • 需以冰冷却避免过热

  • 弗式细胞压碎器(French pressure cell,带壁微生物

    • 细胞在剪切力作用下破碎

  • 研磨(固体组织,微生物)

    • 液氮中将固体组织磨成细粉末

  • 样品研磨器(用于少量样品的处理)

    • 用于精确样品

  • 珠磨法(胞悬液,微生物)

    • 通过磨珠研磨破坏细胞壁


作用

去除杂质

浓缩样品

抑制蛋白酶活性

关键-可溶性

获得可以重新溶解的蛋白

常用方法

硫酸铵沉淀

TCA沉淀

丙酮沉淀

TCA/丙酮沉淀

醋酸铵/甲醇/苯酚抽提

对于疏水性特别强的蛋白如膜蛋白

硫脲

SDS

新型两性表面活性剂(如磺基甜菜碱)

样品的沉淀


样品中杂质的去除

  • 去除原则

    • 尽量不丢失蛋白

    • 减少蛋白的修饰

  • 杂质的主要种类

    • DNA/RNA

    • 脂质

    • 多糖盐

    • 离子去污剂

    • 其他固体杂质


Dna rna
DNA/RNA的去除

  • 样品中含核酸的不利影响

    • 能被银染色法染色

    • 在凝胶酸性部分产生水平条纹

    • 当样品到达IEF凝胶酸性端时,与蛋白质一同沉淀

  • 去除方法

    • 蛋白沉淀法

    • DNase/RNase处理

    • 超声(机械破坏)、超高速离心

    • DNA/RNA抽提(苯酚/氯仿)


其他杂质的去除

  • 脂质

    • 使蛋白质不易溶解且会影响其分子量及pI

    • 丙酮沉淀

  • 多糖

    • 阻塞胶体,影响蛋白质沉淀、聚焦

    • TCA、硫酸铵或醋酸铵/甲苯/苯酚沉淀;超速离心和高pH

    • 使胶条导电能力增强,共聚焦不易发生

    • 透析;胶体过滤;沉淀或重新悬浮

  • 离子去污剂

    • 如SDS,使蛋白质带负电不能聚焦

    • 丙酮沉淀;将含SDS的蛋白溶于含两性或非离子去污剂如CHAPS,Triton X-100,NP-40等的缓冲液中并使SDS终浓度<0.25%

  • 固体杂质

    • 阻塞胶体,影响蛋白质沉淀、聚焦

    • 过滤


样品的溶解

  • 2-DE成功分离蛋白质的最关键因素之一

  • 溶解的目标

    • 样品中非共价结合的蛋白质复合物和聚积体完全破坏,从而形成各个多肽的溶解液(否则样品中结合牢固的蛋白复合物可能使2-DE中出现新的蛋白点,相应的表示单个多肽的点的强度会下降)

    • 溶解方法必须允许可能干扰2-DE分离的盐、脂类、多糖和核酸等物质的去除

    • 溶解方法要保证样品在电泳过程中保持溶解状态


增加样品溶解性的手段

  • 变性剂

    • 改变氢键结构,使蛋白疏水中心暴露伸展

    • 尿素、硫尿

  • 表面活性剂

    • 溶解疏水基团

    • 离子去污剂SDS、非离子去污剂Triton X-100和NP-40、两性离子去污剂CHAPS等

  • 还原剂

    • 使变性蛋白进一步伸展溶解

    • 含自由巯基的DTT或-巯基乙醇,不带电荷的磷酸三丁酯(TPB)

  • 起载体作用的两性电解质

    • 到达平衡位置形成pH梯度,“运载”电流、pH

    • 捕获样品中少量盐分

    • 浓度应小于0.2%(w/v,浓度过高会使IEF的速度降低)


试剂

用量

24g 尿素加入 25mL H2O

8M 尿素

385mg DTT或 500uL 200mM TBP原液

50mM DTT 或2mM TBP

2g

4% CHAPS

0.2%两性电解质载体

见下表

0.0002%溴酚蓝

100uL 0.1% 原液

ddH2O

定容至50mL

样品液的准备

标准液:


IPG 胶pH 范围

样品溶液体积

(/5ml)

样品溶液体积

(/5ml)

两亲性电解液浓度(w/v)

两亲性电解液范围

3-10

3-10

40%

25l

250  l

4-7

4-6

40%

12.5  l

125  l

5-7

40%

12.5  l

125  l

3-6

3-5

40%

25  l

250  l

4-6

40%

12.5  l

125  l

5-8

5-8

40%

25  l

250  l

7-10

7-9

40%

12.5  l

125  l

8-10

20%

25  l

250  l

IPG用两亲性电解液的组成


样品制备注意事项

  • 蛋白质水解

    • 低温

    • Tris碱,碳酸钠或碱性载体两性电解质

    • 蛋白抑制剂

  • 特殊样品的制备

    • 低丰度蛋白的分离

      • 预分级

      • 窄pH胶(<2个pH单位)

    • 强碱性蛋白(如核糖体)的处理

      • 预处理富集

      • 特殊pH梯度的IPG胶条(如pH3-12、4-12或10-12)进行等电聚焦

    • 极端分子量蛋白的处理

      • 小于8kD 对流混合,产生绒毛状或模糊的带

      • 大于200kD的蛋白,变性为多肽


固定pH梯度(Immobilized pH Gradient, IPG)胶条的制备

梯度器

A

D

塑料支持膜

B

E

C

F

pH 3

pH 10


酸缓冲基团:

CH2 = CH-C-NH-R

碱缓冲基团:

NH3+

O

固定pH 梯度(IPG)示意图

丙烯酰胺单体

COO-

R

聚丙烯酰胺凝胶


Ph ph
pH梯度及窄pH梯度

  • 宽pH梯度用于:

    全部蛋白(确定感兴趣蛋白的大致位置)

  • 窄pH梯度用于:

    提高分辨率

    增加载样能力以检测、分析更多蛋白


IPG 胶的重泡涨及上样

重泡涨溶液:

8M 尿素

2% NP-40 或CHAPS

2% IPG缓冲液(两亲性电解液)

0.28% DTT

微量溴酚蓝

2-DE 样品

重泡涨溶液

IPG 胶条支架

IPG胶条

定位

泡涨目的:使样品能完全以可溶形式进入IPG胶条内


蛋白载样量

IPG胶条对蛋白载样量的影响因素:

  • 待分析的蛋白点的量应满足随后的质谱分析待研究蛋白的丰度

  • 样品的复杂度

    • 复杂度较高的样品,为了尽可能的了解所包含的每种蛋白,需要反复实验才能完成。如果将待检样品被富集以后则更易分析。

  • IPG胶条的pH范围

    • 预试验确定

    • 先宽后窄

    • 先线性后非线性

    • 先短后长


支架盖

IPG胶条

电极

电压

时间

第一向:等点聚焦

电极垫

1. 放置电极垫(?)

2. 200 V 维持 1.5h

3. 500 V 维持 1.5h

4. 1000 V 梯度上升1500vh

5. 8000 V 梯度上升(?) 36000vh


IPG胶条的平衡

  • 平衡液

    • 6 M 尿素和30% 甘油

    • 减少电内渗

  • 第一步平衡

    • 加DTT

    • 使变性的非烷基化蛋白处于还原状态

  • 第二步平衡

    • 加碘乙酰胺

    • 使蛋白质巯烷基化,防止其在电泳过程中重新氧化


SDS

SDS-PAGE

SDS-PAGE

使被分离的蛋白质与SDS完整结合

  • 第二向: SDS-PAGE

  • SDS 平衡

  • SDS-PAGE

SDS 平衡液

50 mM Tris-HCl

6 M 尿素

30% 丙三醇

2% SDS

微量溴酚蓝

IPG 胶条

向电泳缓冲液中加

0.5%的琼脂糖

标记纸片

SDS-PAGE


染色方法

  • 胶体考马斯亮蓝染色

    • 灵敏度为30~100ng,线性范围是20倍

    • 可实现PAGE的无背景染色

    • 会对蛋白质进行修饰而影响质谱分析的结果

  • 胺基黑染色

    • 转印至聚偏二氟乙烯(PVDF)上的蛋白质的染色

    • 转印至硝酸纤维素膜上的蛋白质的染色

  • 银染

    • 可减少胶内蛋白质产量

    • 对某些种类的蛋白质染色效果差

    • 对其后的蛋白质测序和质谱分析造成影响


银染色

50% 甲醇

25% 乙酸

4h

ddH2O

30 sec

ddH2O 洗3次

30min/次

3% Na2CO3

0.0185% 甲醛

0.004% DTT 溶液

30min

2.3M 柠檬酸

0.1% AgNO3

30min

5% 乙酸

25% 甲醇


染色方法

  • 负染

    • 主要包括金属盐染料、锌-咪唑染料等的使用

    • 能专门提高PAGE胶上蛋白质的回收率

    • 速度快(5~15min)且能保持蛋白质的生物活性

    • 不能用于膜上染色

    • 适用于蛋白质显色、完整蛋白质的胶上被动提取以及质谱分析

  • 胶体扩散染料

    • 主要包括印度墨水染料、胶体金属染料等

    • 高灵敏度检出电转印至硝酸纤维素和PVDF膜上的蛋白质

    • 灵敏度与PAGE胶内的银染类似

    • 不用于胶内染色


染色方法

  • 有机荧光团染料

    • 包括共价结合和非共价结合的荧光团染料两类,后者最为常用,其典型代表是已经商品化的SYPRO Red、 Orange、 Ruby等荧光染料

    • 可对SDS-PAGE胶内蛋白质进行一步染色,约30~60min完成

    • 灵敏度为2~10ng其线性范围为3个数量级

    • 在Tris/甘氨酸转印缓冲液中染色后,蛋白质可被转印至膜上并进行免疫染色或Edman测序来鉴定蛋白质

  • 金属螯合染料

    • 与现代蛋白质组学研究相兼容的

    • 专门与常用微量化学表征过程兼容

    • 不包含戊二醛、甲醛或Tween-20等,很容易和集成化蛋白质组学平台(包括自动化凝胶染色仪、图像分析工作站、机器人剪切仪器、蛋白质酶解工作站和质谱仪等)相结合


2-DE 分离的可溶性E. coli 蛋白

凝胶的图像处理分析

典型流程

  • 凝胶图像的扫描

  • 图像加工

  • 斑点检测和定量

  • 凝胶配比

  • 数据分析

  • 数据呈递和解释

  • 2-DE数据库的建立


目前双向电泳需解决的问题

  • 样品的制备及溶解

    • 不溶性蛋白(膜蛋白及核内蛋白)

    • 难分离蛋白(如毛发及皮肤中的蛋白)

  • 载样量的提高

  • 初步分离

  • 低丰度蛋白、碱性蛋白及大分子量蛋白

  • 定量分析

  • 灵敏度及可重复性


对于双向电泳的建议

  • 首先采用宽pH范围的胶条,确定蛋白的分布范围,通常采用pH3-10的胶条

  • 如果pH线性分布的胶条分离效果不好,可采用非线性胶条

  • 加大蛋白上样量,提高局部蛋白的分辨率

  • 采用窄pH范围的胶条,提高某pH范围蛋白的分辨率

  • 第二向采用梯度胶进行分离

  • 去除高丰度蛋白,进行蛋白的分级处理,富集低丰度蛋白



质谱基础

检测

质量分选(过滤)

电离

离子检测器

离子源

质量分析器

形成离子

(带电分子)

根据m/z分选离子

检测离子

基本步骤:

1. 样品离子化

2. 根据质量(m/z)不同分离离子

3. 检测每种质量离子的数目

4. 收集、处理数据得到质谱图

样品

  • 固体

  • 液体

  • 蒸汽

数据处理

质谱


质谱的评价指标

  • 质量范围

  • 速度

  • 灵敏度

  • 分辨率

  • 精确度


MH+

MH+

相对强度

MH+

m/z

  • 特点:

  • 灵敏度高

  • 准确度高

  • 分辨率高

激光

  • 质量范围广

  • 图谱简明

  • 速度快

样品探针

基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)

335 nm

+

+

+

自由漂移区

检测器


串联质谱法 (MS/MS)

碰撞气体

TOF质量分析器

ESI-Q-TOF 质谱仪

MCP

检测器

ESI

四级杆质量分析器

步骤:

1质量分析

2碰撞(离子裂解)

3质量分析

反射器

碰撞室


串联质谱的优点

  • 强的抗背景干扰能力

  • 极高的检测灵敏度和准确度

  • 可用来分析复杂混合物中的蛋白质

  • 丰富的检测信息,高通量鉴别蛋白质


1、鉴定和注释蛋白质的路线

  • 通过肽质谱指纹图(peptide mass fingerprinting,PMF)和数据库搜寻匹配

  • 通过串联质谱进行单个或多个蛋白质的鉴定

  • 鸟枪法蛋白质组学


Maldi tof
MALDI-TOF检测的多肽指纹

凝胶

数据库

蛋白质

?

1

2

3

胰酶消化

多肽 已测得质 谱数据或理论 质谱 数据

质谱

3235.2256

1234.5396

783.9147

375.2561

比较:

?? 是否相同??


肽质谱指纹图在数据库中匹配不成功的可能原因

  • 样品量太少,PMF图信噪比太低,输入库中搜寻的数据质量不好。

  • 2-DE胶上所取的一个蛋白质点并非单一蛋白质,所获PMF图实际上是两个以上蛋白质的混合图。


续:

  • 操作中角蛋白或其他蛋白质的污染

  • 蛋白质发生了较多的转译后修饰,数据库中未有记载

  • 所用胰蛋白酶质量不够好,蛋白酶自酶解片段多

  • 未知的新蛋白质

  • 数据库规模太小


串联质谱鉴定多肽的计量方法

蛋白质数据库

?查询

输入

输出

串联质谱图

序列片段

PNT

氨基酸序列

VLDPNTVFAL

从头测序


联合技术精确鉴定蛋白质

  • 组织切片或印片原位质谱分析技术

  • 两级飞行时间串联质谱(MALDI-TOF/TOF)

  • 傅里叶转换回旋共振质谱(FTMS)

  • 表面增强激光解吸/电离飞行时间质谱(SELDI-TOF-MS)


2、基于生物质谱的定量蛋白质组研究策略

原理:对于具有相同离子化能力的蛋白质或多肽,可以通过比较质谱峰的强度(或峰面积)得到待比较蛋白质的相对量。


3、基于质谱的蛋白质相互作用研究方法

  • 靶蛋白制备

  • 蛋白质复合体的纯化

  • 蛋白质复合体的质谱鉴定

基本步骤:


(1)亲和层析耦联质谱技术

  • 基本原理:将某种蛋白质以共价键固定在基质(如琼脂糖)上,含有与之相互作用的蛋白质的细胞裂解液过柱,先用低盐溶液洗脱下未结合的蛋白质,然后用高盐溶液或SDS溶液洗脱结合在柱子上的蛋白质,最后用多维液相色谱耦联质谱技术(MDLC-ESI-MS/MS)鉴定靶蛋白的结合蛋白。


先决条件

  • 得到足够多的保持生物活性的重组靶蛋白作为诱饵(bait)

  • 获得足够量、纯度高的与诱饵相互作用的蛋白质


利用含靶蛋白的融合蛋白获得相互作用蛋白质

  • 谷胱甘肽S转移酶(glutathione S-transferase,GST)融合蛋白

  • 蛋白A融合蛋白


主要优点

  • 灵敏度高:高浓度靶蛋白

  • 候选蛋白质与靶蛋白的结合机会均等

  • 检测多亚基蛋白质之间的相互作用


(2) 免疫共沉淀耦联质谱技术

  • 原理:以细胞内源性靶蛋白为诱饵,用抗靶蛋白抗体与细胞总蛋白进行免疫共沉淀(immuno-precipitation,IP)纯化靶蛋白免疫复合物,凝胶电泳分离后,质谱鉴定靶蛋白的结合蛋白。


研究鼻咽癌细胞系中的p53相互作用蛋白

  • 抗p53抗体与HNE1和HNE2总蛋白进行免疫共沉淀

  • SDS-PAGE分离免疫沉淀复合物

  • 切取p53结合蛋白条带,酶解后进行电喷雾串联质谱(LC-ESI-MS/MS)分析,得到相应的肽序列标签

  • 搜索数据库


特 点

  • 生理条件下蛋白质之间的相互作用

  • 所有蛋白质与靶蛋白的相互作用

  • 可检测依赖于修饰的蛋白质相互作用


局 限 性

A. 灵敏性不高

B. 假阳性

C. 受免疫球蛋白的干扰较大


(3)生物传感器耦联质谱技术

  • Biacore基于表面等离子共振(SPR)进行生物大分子相互作用分析(BIA)

  • 质谱(MALDI-TOF-MS或LC-ESI-MS/MS )鉴定Biacore芯片上配体所捕获的生物分子

组 成


Biacore的基本工作原理

当生物大分子结合(如蛋白质相互作用)时会引起作用表面(芯片)折射率的变化,这种光信号可被光感受器接受并转换成电信号传送到计算机,再由计算机还原为模拟的生物信号。


(4)串联亲和纯化耦联质谱技术

  • 基本原理:在靶蛋白一端或中部嵌入蛋白质标记(TAP Tag),经过特异性的两步亲和纯化,在生理条件下与靶蛋白相互作用的蛋白质便可洗脱下来,然后用质谱技术对得到的蛋白质复合体进行鉴定。


主要流程

双重分子标签构建到靶蛋白

表达融合蛋白

制备细胞裂解液

IgG柱纯化

TEV蛋白酶的洗脱液洗脱蛋白质复合体


续:

耦联钙调素的亲和柱纯化

洗脱

含EGTA的洗脱液洗脱

质谱鉴定结合蛋白质


特 点

  • 获得生理条件下与靶蛋白相互作用的蛋白质

  • 鉴定出在空间上非直接物理相互作用的蛋白质

  • 适用于大规模蛋白质相互作用研究



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