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Meccanismi di tossicità. Meccanismi Meccanismi specifici non specifici Tossine animaliComposti organici Composti e vegetali di sintesi inorganici Farmaci . Meccanismi specifici.

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Meccanismi di tossicità

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Meccanismi di tossicit l.jpg

Meccanismi di tossicità

MeccanismiMeccanismi

specificinon specifici

Tossine animaliComposti organici Composti

e vegetali di sintesi inorganici

Farmaci


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Meccanismi specifici

  • Interazione selettiva con specifiche proteine (enzimi, canali ionici, trasportatori ecc.)  danneggiamento di funzioni cellulari specifiche  tossicità cellulare e/o d’organo.

  • In genere legame non covalente.

  • Razionale biologico?: selezionate sostanze non tossiche per l’organismo che le produce; a scopo difensivo, l’effetto tossico deve essere intenso e manifestarsi a breve termine.


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Meccanismi non specifici

  • La sostanza o un suo metabolita reattivo (es.: radicale libero, elettrofilo), reagiscono in modo aspecifico con diversi componenti cellulari (proteine, lipidi, acidi nucleici).

  • Si formano o si rompono legami covalenti (formazione di addotti; ossidazioni; sottrazione di atomi).

  • Ciò causa alterato funzionamento o distruzione dei componenti cellulari colpiti  tossicità cellulare  tossicità di organo/sistema.

  • In genere, non è chiaro quali dei numerosi siti di attacco cellulare siano responsabili dell’effetto tossico.


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  • Questo tipo di meccanismo è dovuti quasi sempre alla formazione di metaboliti reattivi e non alla sostanza tal quale.

  • Perché?


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  • Alcune sostanze modificano la composizione dei fluidi biologici:

  • pH (acidi e basi);

  • composizione ionica (sali, chelanti);

  • cofattori enzimatici (deplezione, malassorbimento)

  • concentrazione di metaboliti intermedi (stimolazione o inibizione di vie metaboliche; es.: porfiria, steatosi)

    Queste alterazioni causano tossicità cellulare e/o d’organo.


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  • N.B.: oltre a tossine che agiscono in modo selettivo, i vegetali contengono anche molti composti che danno tossicità con meccanismo non specifico. Molti farmaci e alcuni altri composti organici di sintesi danno tossicità con meccanismo specifico.


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Tipi di tossicità

  • Tossicità funzionale: alterazioni delle funzioni di un sistema (nervoso, cardiovascolare, endocrino)  possibile danno d’organo.

  • Citotossicità: alterazione irreversibile di proteine (enzimi, canali ionici ecc.) o membrane (lipidi); disregolazione del metabolismo  necrosi, apoptosi  tossicità tissutale e d’organo o sistema (fegato, rene, SNC ecc.).

  • Genotossicità: alterazione del DNA  mutazioni, alterazioni cromosomiche  cancerogenesi, malattie congenite.

  • Reazioni allergiche: allergeni, apteni, modificatori degli antigeni cellulari  risposta immunitaria.


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1. Alterazione delle normali funzioni cellulari senza danno cellulare primario diretto (tossicità ‘funzionale’)  tossicità d’organo o sistema (tossicità cellulare secondaria)

Esempi:

  • Una sostanza che provochi vasodilatazione (es., alfa1-bloccante, agonista istaminergico) non causa danni diretti ai vasi ma provoca ipotensione e riduzione del flusso ematico 

danni cerebrali, renali ecc

Una sostanza che causa contrazione della muscolatura vasale (es. agonista adrenergico) non danneggia i vasi ma causa

tossicità cardiaca, cerebrale, renale.


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  • Una sostanza che stimoli il rilascio di insulina dalle cellule pancreatiche (senza danneggiarle) causa

ipoglicemia e tossicità a carico del sistema nervoso centrale (danno neuronale indiretto)

  • Una sostanza antagonista degli ormoni sessuali può causare

tossicità riproduttiva senza causare danno diretto alle cellule dell’apparato riproduttivo


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  • Danno cellulare (citotossicità).

  • L’alterato funzionamento o la distruzione della macromolecola bersaglio provoca una danno cellulare

  • L’entità di tale danno dipende da:

  • importanza della funzione del componente cellulare colpito

  • capacità di riparazione da parte della cellula (rimozione dei componenti danneggiati e loro sostituzione )


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citotossicità

  • Se il danno è irreversibile e/o esteso e/o coinvolge componenti cellulari essenziali, si ha la morte cellulare (necrosi).

  • Nella maggior parte dei tessuti, le cellule morte possono essere sostituite da cellule dello stesso tipo (divisione cellulare)  riparazione totale del danno. N.B.: i neuroni non possono replicarsi.

  • Se l’area necrotica è estesa, si ha infiammazione e formazione di tessuti connettivi di riparazione (tessuti cicatriziali)  riparazione parziale del danno (la funzionalità dell’organo è diminuita o alterata).


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citotossicità

  • Se l’insulto cellulare non è ‘grave’, si può avere alterazione del metabolismo della cellula senza morte cellulare.

  • In questi casi si possono avere alterazioni di:

  • dimensioni cellulari (atrofia o ipertrofia)

  • proliferazione e differenziazione cellulare (iperplasia, metaplasia)

  • accumulo di componenti cellulari (es. steatosi epatica)


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citotossicità

La morte cellulare può avvenire per necrosi o per apoptosi


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citotossicità


Siti di attacco cellulare l.jpg

citotossicità

Siti di attacco cellulare

  • Membrane:

  • Lipidi: perossidazione

  • Proteine: enzimi, canali, pompe, trasportatori: alterazione della funzionalità


Perossidazione lipidica l.jpg

citotossicità: danno alle membrane

Perossidazione lipidica

  • Avviene ad opera di radicali (liberi): meccanismo non specifico

  • Dato che i radicali hanno molti altri punti bersagli cellulari (proteine, DNA), il suo ruolo nel danno cellulare in molti casi non è ben definito (causa o effetto?)


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La perossidazione porta alla distruzione dei lipidi  alterazione della struttura della membrana  alterazioni della funzionalità. I lipidi ossidati possono a loro volta ossidare le proteine di membrana. La formazione di radicali può danneggiare strutture distanti dal sito iniziale d’attacco.


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  • Nella perossidazione lipidica si formano prodotti di degradazione;

  • questi sono utilizzati per misurare il grado di perossidazione; in genere si misura la formazione della malonildialdeide (dialdeide malonica)


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CCl4


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GSH-Px(u/mg protein)

MDA(nmol/mg protein)

Control

45.4±5.9

4.15±0.5

CCl4

34.5±3.1*

5.55±0.7*

CCl4+Interferon

46.5±6.4**

4.27±0.3**

Esempio; valutazione dell’effetto ossidativo in ratti trattati con CCl4 (s.c.) per 7 settimane

Oxidative stress markers

Mean renal MDA (malondialdehyde)and GSH-Px (glutathione peroxidase)levels in the control, CCl4 and CCl4+INF groups

*p<0.01 vs. control, **p>0.05 vs. control.


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citotossicità

Sbilanciamento dei sistemi redox cellulari

  • La cellula ha numerosi sistemi redox, necessari al corretto metabolismo (GSH/GSSG, NAD/NADH, NADP/NADPH, piruvato/lattato ecc.).

  • L’attività di molte proteine (enzimi, fattori di trascrizione ecc.) è regolata dallo stato redox della cellula.


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Regolazione dell’attività di una monoossigenasi flavinica da parte dello stato redox (GSH/GSSG)


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Figure 1. Diagram of the NF-kB activation pathway indicating the steps where there is evidence for direct modulation by reactive oxygen species (ROS)


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  • La diminuzione di GSH comporta, tra l’altro, una diminuita protezione nei confronti dell’ossidazione dei tioli proteici  alterazioni strutturali e funzionali.

  • La detossificazione di ossidanti e radicali comporta un consumo di equivalenti riducenti ed un conseguente sbilanciamento dei sistemi redox  alterazioni del metabolismo cellulare.


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citotossicità

  • L’alterazione dei sistemi redox può anche causare effetti tossici indirettamente.

  • Es.: la detossificazione di H2O2 da parte della glutatione perossidasi porta alla formazione di glutatione ossidato (GSSG); la rigenerazione di glutatione ridotto ad opera della glutatione reduttasi comporta il consumo di NADPH  alterazione del rapporto NAPD/NADPH  alterazione di molte funzioni cellulari (es. efflusso di Ca++ dai mitocondri).


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citotossicità

  • Anche lo sbilanciamento verso lo stato ridotto altera il metabolismo.

  • Ad esempio, l’etanolo viene ossidato in due stadi ad acetato:

  • etanolo + NAD  acetaldeide + NADH

  • acetaldeide + NAD  acetato + NADH

  • Negli alcolisti si ha quindi una sovrapproduzione di NADH, che favorisce la riduzione di piruvato a lattato e di ossalacetato a malato, diminuendo così la gluconeogenesi.

  • Il risultato finale è una condizione di ipoglicemia.


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citotossicità

Disregolazione metabolica. Principali meccanismi

  • Inibizione del metabolismo energetico (produzione di ATP)

  • Aumento del Ca++ libero intracellulare

  • Alterazione della sintesi di macromolecole (acidi nucleici, proteine)


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citotossicità

  • Inibizione della produzione di ATP

  • Può avvenire per blocco della glicolisi (es. iodoacetato) o della respirazione mitocondriale (es., cianuro, disaccoppianti)


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Il gradiente di H+ viene utilizzato per generare ATP.

I disaccoppianti provocano un trasporto di H+ passivo attraverso la membrana  inibizione della sintesi di ATP.


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CN- si lega al Fe+3 del gruppo eme  blocco del flusso degli elettroni


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citotossicità

  • Inibizione totale  necrosi cellulare

  • Inibizione parziale e/o temporanea  riduzione del metabolismo, ridotta capacità rigenerativa, aumentata sensibilità a stimoli tossici


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citotossicità

  • Aumento del Ca++ intracellulare

  • La concentrazione di Ca++ intracellulare libero è strettamente regolata poiché Ca++ è necessario per l’attività di molti enzimi (proteasi, fosfolipasi, endonucleasi ecc.) e regola molte attività cellulari

  • Sostanze che danneggiano i sistemi responsabili del mantenimento della concentrazione di Ca++ provocano un suo aumento con attivazione di molti enzimi litici e conseguente morte cellulare (necrosi o apoptosi).


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proteasi Ca-dipendenti

proteasi lisosomiali


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Sinergismo in tossicologia

Molto importante per esposizione contemporanea a molte sostanze diverse.

L’esposizione ad una sostanza, in modalità non tossiche, determina un aumento della tossicità di una seconda sostanza


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Acetaminophen Overdose

  • Dose related toxicity in low risk patient:

  • < 125 mg/kg (8.75 g in 70 kg person) - rare liver toxicity

  • >250 mg/kg (17.5 g) considered "minimum hepatotoxic dose"

  • > 350 mg/kg (24.5 g) -- invariably severe liver damage

  • High risk patient:

  • In chronic ethanol abusers, hepatic necrosishas been reported with short-term use of paracetamol dosages of 2.5 g/day. Fatalities have occurred.


Reazioni allergiche e autoimmuni indotte da metaboliti reattivi l.jpg

Reazioni allergiche e autoimmuni indotte da metaboliti reattivi

  • Diverse sostanze possono modulare in modo aspecifico il sistema immunitario, determinando immunosoppressione (più comune)o immunostimolazione generalizzata (più raro, es.; silicosi, esaclorobenzene)

  • Molte sostanze si comportano da allergeni o apteni, inducendo una risposta immunitaria  reazioni allergiche (Tipo I-IV).

  • I metaboliti reattivi di alcune sostanze si legano covalentemente ad alcune proteine, modificandone le caratteristiche immunitarie  malattia autoimmunitaria (es. epatite da alotano).


Formazione di composti tossici in vivo meccanismi di detossificazione l.jpg

Formazione di composti tossici in vivo. Meccanismi di detossificazione

  • Formazione di radicali.

  • Per ossidazione di fenoli, idrochinoni, amine, idrazine. tioli ecc. da parte di CYP450 o perossidasi: R  R.+ + 1e si forma una radicale cationico, che può sottrarre un atomo di idrogeno a lipidi ed altre molecole (proteine, DNA, glutatione ecc.).

  • Per scissione omolitica di un legame C-H; es: CCl4 subisce dealogenazione riduttiva ad opera di CYP450; si forma il radicale triclorometilico CCl3.


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  • Per riduzione ad opera della CYP450 reduttasi (e altre reduttasi): R + 1e  R.- (radicale anionico); es.: doxorubicina, nitrofurantoina.

  • I radicali anionici cedono il loro elettrone spaiato all’O2, formando cosi l’anione superossido:

    R.- + O2  R + O2 .-


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L’anione superossido viene trasformato dalla superossido dismutasi (SOD) in perossido di idrogeno (H2O2);

H2O2 (un ossidante) viene detossificato dalla catalasi:

H2O2 H2O + ½ O2

Tuttavia, la formazione di anione superossido e/o di perossido di idrogeno può superare le capacità detossificanti di SOD e catalasi.

H2O2 può ricevere un elettrone da ioni metallici (Fe++, Cr(V) ecc.), formando il radicale ossidrile (reazione di Fenton):

H2O2 OH. + OH-

Il radicale OH. è estremamente reattivo e non può essere inattivato dagli antiossidanti


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Anione superossido, perossido di idrogeno e radicale ossidrile vengono definiti ROS (Reactive Oxygen Species)


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  • I ROS sono prodotti continuamente nel nostro organismo. Ad esempio la reazione:

  • Hypoxanthine + O2 <=> Xanthine + H2O2

  • (catalizzata dalla xantina ossidasi) genera perossido di idrogeno

  • I ROS prodotti dalle cellule fagocitarie svolgono un ruolo nella difesa dagli agenti infettivi.

  • I radicali possono danneggiare anche proteine (principalmente ossidazione dei tioli) e DNA


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Meccanismi di detossificazione dei ROS

Protezione enzimatica

Glutatione perossidasi

H2O2 + 2 GSH H2O + GSSG

Glutatione ridotto Glutatione ossidato


Altri meccanismi di detossificazione dei radicali l.jpg

Altri meccanismi di detossificazione dei radicali

Il glutatione ridotto (GSH) reagisce con i radicali, cedendo un elettrone; si forma così il radicale tiilico GS. (relativamente stabile); l’unione di 2 radicali GS. porta alla formazione di glutatione ossidato (GSSG), che viene poi ridotto dalla glutatione reduttasi (NADPH-dipendente)


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Antiossidanti

  • Vitamina E (alfa-tocoferolo), vitamina C (acido ascorbico) ed altri antiossidanti (es.: ß-carotene) reagiscono con i radicali liberi, cedendo un elettrone e trasformandosi in radicali ‘stabili’ o detossificati dai sistemi enzimatici.


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La reazione del radicale perossilico con la Vitamina E è molto più veloce della reazione con un altro lipide (109vs 106 nmoli/sec)


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Membrane lipid peroxidation. (a) Initiation of the peroxidation process by an oxidizing radical X · , by abstraction of a hydrogen atom, thereby forming a pentadienyl radical. (b) Oxygenation to form a peroxyl radical and a conjugated diene. (c) Peroxyl radical moiety partitions to the water-membrane interface where it is poised for repair by tocopherol. (d) Peroxyl radical is converted to a lipid hydroperoxide, and the resulting tocopherol radical can be repaired by ascorbate. (e) Tocopherol has been recycled by ascorbate; the resulting ascorbate radical can be recycled by enzyme systems. The enzymes phospholipase A2 (PLA2), phospholipid hydroperoxide glutathione peroxidase (PH-GPx), glutathione peroxidase (GPx) and fatty acyl-coenzyme A (FA-CoA) cooperate to detoxify and repair the oxidized fatty acid chain of the phospholipid. (from Buettner 1993).


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NEJM, Vol. 334:1150-1155

May 2, 1996

Number 18

E’ possibile aumentare la capacità detossificante tramite la somministrazione di antiossidanti?

Effects of a Combination of Beta Carotene and Vitamin A on Lung Cancer and Cardiovascular Disease

Gilbert S. Omenn, M.D., Ph.D., Gary E. Goodman, M.D., M.S., Mark D. Thornquist, Ph.D., John Balmes, M.D., Mark R. Cullen, M.D., Andrew Glass, M.D., James P. Keogh, M.D., Frank L. Meyskens, M.D., Barbara Valanis, Dr.P.H., James H. Williams, M.D., Scott Barnhart, M.D., M.P.H., and Samuel Hammar, M.D.


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Methods We conducted a multicenter, randomized, double-blind,placebo-controlled primary prevention trial — the Beta-Caroteneand Retinol Efficacy Trial — involving a total of 18,314smokers, former smokers, and workers exposed to asbestos.

Theeffects of a combination of 30 mg of beta carotene per day and25,000 IU of retinol (vitamin A) in the form of retinyl palmitateper day on the primary end point, the incidence of lung cancer,were compared with those of placebo.


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Formazione di elettrofili

  • Si formano direttamente per ossidazione, principalmente da parte di CYP450 (es. epossidi di alcheni o aromatici), o per ossidazione e successivo riarrangiamento (es. N-ossidazione di amine).


Attivazione metabolica formazione di metaboliti reattivi da parte del cyp450 l.jpg

Attivazione metabolica: formazione di metaboliti reattivi da parte del CYP450

  • L’ossidazione da parte del CYP450 può portare alla formazione di composti elettrofili o radicalici (o loro precursori).

  • Epossidi

  • Chinoni, idrochinoni, chinonimmine

  • N-idrossi ammine

  • Radicali alchilici alogenati

  • N.B. non tutti i composti di queste classi sono tossici; la loro tossicità dipende dalla loro reattività chimica, che dipende dalla struttura dell’intera molecola.

  • N.B. in diversi casi (es. aflatossina B1), il CYP450 catalizza sia l’attivazione sia la detossificazione


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  • Gli elettrofili ed i radicali cationici si legano covalentemente ai numerosi gruppi nucleofili presenti in macromolecole, proteine ed acidi nucleici.

  • La reazione con le proteine può portare ad alterazioni della loro funzionalità (es. inibizione enzimatica) e delle loro caratteristiche antigeniche (patologie autoimmuni da xenobiotici).

  • La reazione con il DNA può portare a mutazioni  cancerogenesi.

  • La reattività degli elettrofili verso i nucleofili è determinata dalla loro natura: elettrofili soft reagiscono preferenzialmente con nucleofi soft, elettrofili hard con nucleofili hard


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  • Se l’ammina viene N-idrossilata (da CYP450) prima di essere acetilata, la NAT può, in questo caso, catalizzare una O-acetilazione.

  • Il gruppo acetossi che si forma è un buon ‘gruppo uscente’.

  • Si può formare uno ione nitrenio, elettrofilo altamente reattivo.


Meccanismi di detossificazione degli elettrofili l.jpg

Meccanismi di detossificazione degli elettrofili

  • Coniugazione con glutatione. Il gruppo tiolico del glutatione è nucleofilo. La reazione può essere spontanea o catalizzata dalla glutatione-S-transferasi (enzima di fase II).

  • Detossificazione enzimatica: epossido idrolasi; riduzione enzimatica (es. chinoni, DT-diaforasi); ossidazione enzimatica (es. aldeidi, aldeide deidrogenasi)


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  • ‘Fallimento’ dei meccanismi di detossificazione

  • Saturazione del potere detossificante: saturazione enzimatica, consumo dei coenzimi, deplezione delle molecole protettive (glutatione, es. paracetamolo)

  • Reversibilità delle reazioni di coniugazione (es. naftilammine; i glucuronidi sono idrolizzati nel rene  rilascio del composto ossidato  formazione di metaboliti elettrofili tossici)

  • In alcune reazioni di detossificazione si possono formare composti tossici (es. GS.)


Meccanismi di riparazione l.jpg

Meccanismi di riparazione

  • Riparazione molecolare:

  • proteine: degradazione e neosintesi; riparazione enzimatica di specifici gruppi (es. riduzione di ponti disolfuro)

  • lipidi: idrolisi + riduzione dell’acido grasso perossidato (ossidazione del glutatione); ri-acilazione


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Riparazione del DNA

  • Il DNA subisce continuamente danni di vario tipo

  • Esistono diversi meccanismi di riparazione, che sono essenziali al mantenimento dell’integrità del DNA

  • I meccanismi di riparazione richiedono tempo

  • Il danno al DNA determina, tra l’altro, un arresto della progressione del ciclo cellulare, in modo da consentire la riparazione del danno.

  • Se il danno è troppo esteso e non può essere riparato, si può avere apoptosi

  • Se il danno non viene riparato e la cellula non va incontro ad apoptosi, il danno del filamento di DNA induce una mutazione nel filamento figlio se la cellula si replica  i livelli di mutazione aumentano con la velocità di divisione cellulare


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Mutation

Types and rates of mutation

Type Mechanism Frequency________

Genome chromosome10-2 per cell division

mutation misaggregation

(e.g., aneuploidy)

Chromosome chromosome6 X 10-4 per cell division

mutation rearrangement

(e.g., translocation)

Gene base pair mutation10-10 per base pair per

mutation (e.g., point mutation, cell division or

or small deletion or 10-5 - 10-6 per locus per

insertion generation


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Summary of DNA lesions

Missing baseAcid and heat depurination (~104 purines

per day per cell in humans)

Altered baseIonizing radiation; alkylating agents

Incorrect baseSpontaneous deaminations

cytosine to uracil

adenine to hypoxanthine

Deletion-insertionIntercalating reagents (acridines)

Dimer formationUV irradiation

Strand breaksIonizing radiation; chemicals (bleomycin)

Interstrand cross-linksPsoralen derivatives; mitomycin C

(Tautomer formationSpontaneous and transient)


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Types of base pair mutations

normal sequence

CATTCACCTGTACCA

GTAAGTGGACATGGT

base pair substitutions

transition: pyrimidine to pyrimidine

transversion: pyrimidine to purine

transversion (T-A to G-C)

transition (T-A to C-G)

CATGCACCTGTACCA

GTACGTGGACATGGT

CATCCACCTGTACCA

GTAGGTGGACATGGT

deletion

insertion

CATCACCTGTACCA

GTAGTGGACATGGT

CATGTCACCTGTACCA

GTACAGTGGACATGGT

deletions and insertions can involve one

or more base pairs


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Spontaneous mutations can be caused by tautomers

Tautomeric forms of the DNA bases

Adenine

Cytosine

AMINO

IMINO


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Tautomeric forms of the DNA bases

Guanine

Thymine

KETO

ENOL


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Mutation caused by tautomer of cytosine

Cytosine

Normal tautomeric form

Guanine

Cytosine

Rare imino tautomeric form

Adenine

  • cytosine mispairs with adenine resulting in a transition mutation


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C

G

and

Mutation is perpetuated by replication

C

G

C

G

C

G

and

  • replication of C-G should give daughter strands each with C-G

C

G

C

A

  • tautomer formation Cduring replication will result in mispairing

  • and insertion of an improper A in one of the daughter strands

C

A

T

A

  • which could result in a C-G to T-A transition mutation in the next

  • round of replication, or if improperly repaired


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Chemical mutagens

Deamination by nitrous acid


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Derivation by hydroxylamine

Alkylation by dimethyl sulfate causes depurination

The formation of a quarternary nitrogen destabilizes the

deoxyriboside bond and the base is released from deoxyribose


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Attack by oxygen radicals


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Thymine dimer formation by UV light


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DNA damage, repair mechanisms and consequences. a, Common DNA damaging agents (top); examples of DNA lesions induced by these agents (middle); and most relevant DNA repair mechanism responsible for the removal of the lesions (bottom). b, Acute effects of DNA damage on cell-cycle progression, leading to transient arrest in the G1, S, G2 and M phases (top), and on DNA metabolism (middle). Long-term consequences of DNA injury (bottom) include permanent changes in the DNA sequence (point mutations affecting single genes or chromosome aberrations which may involve multiple genes) and their biological effects. Abbreviations: cis-Pt and MMC, cisplatin and mitomycin C, respectively (both DNA-crosslinking agents); (6–4)PP and CPD, 6–4 photoproduct and cyclobutane pyrimidine dimer, respectively (both induced by UV light); BER and NER, base- and nucleotide-excision repair, respectively; HR, homologous recombination; EJ, end joining.


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Excision repair (base or nucleotide)

deamination

ATGCUGCATTGA

TACGGCGTAACT

uracil DNA glycosylase

ATGCGCATTGA

TACGGCGTAACT

repair nucleases

AT GCATTGA

TACGGCGTAACT

DNA polymerase b

ATGCCGCATTGA

TACGGCGTAACT

DNA ligase

ATGCCGCATTGA

TACGGCGTAACT

Base excision repair

Nucleotide excision repair

thymine dimer

ATGCUGCATTGATAG

TACGGCGTAACTATC

excinuclease

AT AG

TACGGCGTAACTATC

(~30 nucleotides)

DNA polymerase b

ATGCCGCATTGATAG

TACGGCGTAACTATC

DNA ligase

ATGCCGCATTGATAG

TACGGCGTAACTATC


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Mechanism for base-excision repair


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Homologous recombination: riparazione di rotture della doppia elica

the 5'–3' exonuclease activity exposes both 3' ends.

Identification of a homologous sequence.

After identification of the identical sister chromatid sequence, the intact double-stranded copy is used as a template to properly heal the broken ends by DNA synthesis (III).

Finally, the so-called Holliday-junctions are resolved by resolvases


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Mismatch (post-replication) repair

Heterodimers of hMSH2/6 recognize single-base or insertion/deletion loops

Heterodimeric complexes interact with MSH complexes and replication factors.

Excision of the new strand past the mismatch and resynthesis

N.B. la riparazione post-replicativa è error prone


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  • Mechanisms of Repair

  • Mutations that occur spontaneously any time are repaired by

  • excision repair (base excision or nucleotide excision)

  • Mutations that occur during DNA replication are repaired when

  • possible by proofreading by the DNA polymerases

  • Mutations that are not repaired by proofreading are repaired

  • by mismatched (post-replication) repair followed by

  • excision repair


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Difetti congeniti dei meccanismi di riparazione del DNA predispongono allo sviluppo di tumori.


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  • Defects in DNA repair or replication

  • All are associated with a high frequency of chromosome

  • and gene (base pair) mutations; most are also associated with a

  • predisposition to cancer, particularly leukemia

  • Xeroderma pigmentosum

    • caused by mutations in genes involved in nucleotide excision repair

    • associated with a 2000-fold increase of sunlight-induced

    • skin cancer and with other types of cancer such as melanoma

  • Ataxia telangiectasia

    • caused by gene that detects DNA damage

    • increased risk of X-ray

    • associated with increased breast cancer in carriers

  • Fanconi anemia

    • increased risk of X-ray

    • sensitivity to sunlight

  • Bloom syndrome

    • caused by mutations in a a DNA helicase gene

    • increased risk of X-ray

    • sensitivity to sunlight

  • Cockayne syndrome

    • caused by a defect in transcription-linked DNA repair

    • sensitivity to sunlight

  • Werner’s syndrome

    • caused by mutations in a DNA helicase gene

    • premature aging


Slide85 l.jpg

Correlation between DNA repair

activity in fibroblast cells from

various mammalian species and

the life span of the organism

There is a direct correlation between DNA repair enzymatic activity and the life span of organisms, suggesting

that DNA repair activity slows down cellular senescence and that cellular senescence is caused by mutations in

DNA.

Defects in DNA repair or replication can lead to a number of abnormalities.

100

human

elephant

cow

Life span

10

hamster

rat

mouse

shrew

1

DNA repair activity


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  • Se i meccanismi di riparazione del DNA falliscono e la cellula non si attivano i meccanismi dell’apoptosi, la mutazione viene fissata nelle cellule figlie.

  • Se la mutazione altera la funzionalità di geni che stimolano (proto-oncogeni) o inibiscono la progressione della cellula nel ciclo cellulare (geni repressori dei tumori; p53 induce anche l’apoptosi), si ha la trasformazione neoplastica della cellula.


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The role of p53 in the cell cycle

apoptosis (cell death)

DNA synthesis

UV irradiation leads

to cell cycle arrest

S

p53

phase

G0

G1

phase

Quiescent cells

G2

phase

Growth and

preparation for

cell division

M

phase

Mitosis


Slide89 l.jpg

Multistep carcinogenesis

Stages in the evolution of colon cancer

Chromosome 5q gene loss or mutation

Normal

colon cell

Increased

cell growth

Ras gene mutation

Adenoma

I

Chromosome 18 loss or mutation

DCC tumor suppressor gene

Adenoma

II

Adenoma

III

Carcinoma

Chromosome 17 loss or mutation

p53 tumor suppressor gene

Metastasis

Other chromosome losses


Riparazione tissutale l.jpg

Riparazione tissutale

  • Riparazione

  • Morte delle cellule danneggiate

  • Sostituzione delle cellule morte (proliferazione) e della matrice extracellulare


Slide91 l.jpg

Morte cellulare

  • Livello di esposizione all’agente necrogenico:

  • basso  apoptosi; indotta da danno a DNA, anche indiretto, se la riparazione del DNA fallisce

  • alto  necrosi

    L’apoptosi elimina le cellule danneggiate senza reazione infiammatoria; previene inoltre la trasformazione neoplastica.


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Proliferazione cellulare

  • Sono coinvolti vari tipi cellulari

  • Negli organi parenchimali (fegato, rene, polmoni), il danno necrotico induce la produzione, da parte di cellule non parenchimali (macrofagi, cellule endoteliali), di fattori che stimolano la divisione cellulare e la sintesi di matrice extracellulare.


Slide93 l.jpg

Themammalian cell cycle

DNA synthesis and

histone synthesis

Rapid growth and

preparation for

DNA synthesis

S

phase

G0

G1

phase

Quiescent cells

G2

phase

Growth and

preparation for

cell division

M

phase

de-differenziazione

Mitosis


Slide95 l.jpg

  • Il grado di divisione cellulare può essere valutato dalla sintesi di DNA l’incorporazione di 3H-timidina è un indicatore di sintesi di DNA.


Riparazione tissutale e necrosi l.jpg

Riparazione tissutale e necrosi

  • La necrosi di un tessuto, indotta da una sostanza citotossica, avviene quando l’entità del danno è tale da sormontare i meccanismi di riparazione:

  • riparazione molecolare

  • apoptosi

  • sostituzione delle cellule danneggiate

    Ad es., il clordecone (insetticida), blocca la proliferazione cellulare in risposta a CCl4  CCl4 causa necrosi a dosi normalmente non tossiche.


Slide97 l.jpg

Effetti istologici di CCl4 nel fegato

Figure 2. Detection of PrP mRNA expression in rat liver tissue. Untreated ((a, c) ) and CCl4-treated ((b, d–f)) rat livers were stained with Azan-Mallory stain ((a, b) ) and in situ hybridization for PrP mRNA expression with antisense riboprobe ((c, d, f)) and sense probe ((e)).


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Infiammazione

  • Il danno tissutale causa il rilascio di citochine infiammatorie (TNF, IL-1) da parte dei macrofagi residenti (nel fegato le cellule di Kupffer)  inizio della reazione infiammatoria.

  • I mediatori dell’infiammazione aumentano il danno.


Slide100 l.jpg

Institution: Corso di Laurea in Servizio Sociale - Univ. La SapienzaSign In as Personal Subscriber

N.B.: GdCl3 elimina selettivamente le cellule di Kupffer

FIG. 1. GdCl3 protects against MCT/LPS-induced liver injury. LPS (7.4 x 106 EU/kg) or saline vehicle (Veh) was administered, iv, to rats 4 h after ip administration of MCT (100 mg/kg) or saline vehicle. Rats were pretreated with 10 mg GdCl3-6H2O/kg or saline vehicle, iv, 24 h before LPS administration. TNF- concentration (A), ALT (B) and AST (C) activities, and HA concentration (D) were evaluated in plasma 18 h after MCT administration.


Slide101 l.jpg

  • Le citochine rilasciate da macrofagi e cellule endoteliali alterano la sintesi delle proteine epatiche:

  • proteine di fase acuta (positive): proteina C-reattiva, alfa2-macroglobulina, alfa1-antiproteasi ecc.; oltre a svolgere uno ruolo fisiologico (inibizione proteasi ecc.) hanno valore diagnostico.

  • proteine di fase acuta negative: albumina, transferrina ecc.


Fibrosi l.jpg

Fibrosi

  • Danno cellulare  proliferazione cellulare + produzione di matrice extracellulare, mediata principalmente da TGF-.

  • La sovrapproduzione di TGF- cessa quando il danno tissutale è riparato. Se ciò non avviene, si sviluppa fibrosi.


Slide104 l.jpg

Ratti trattati con CCl4 (s.c.) per 9 settimane

Fibrosi misurata come contenuto in idrossiprolina


Slide105 l.jpg

The protein collagen is unusual in its widespread modification of proline to 4-hydroxyproline (also called hydroxyproline).

Enzymatic hydroxylation of procollagen proline residues in the synthesis of collagen


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