Možnosti diagnostiky zápalových ochorení čreva v skríningu nepriamou imunofluorescenciou (NIF)

1. P. Gomolčák, K. Beráková,D. Paulenová Možnosti diagnostiky zápalových ochorení čreva v skríningunepriamou imunofluorescenciou (NIF) Cytopathos, spol. s r.o. Bratislava Košice, 25.septembra 2010

2. Princíp a definícia NIF Detekcia cirkulujúcich orgánovo špecifických a orgánovo nešpecifických protilátok na tkanivových rezoch, bunkových náteroch a bunkových kultúrach nepriamou imunofluorescenčnou metódou(NIF) je IN SITU vyšetrenie, pri ktorom dokazujeme prítomnosť protilátok v sére pacienta demaskovaním komplexu pomocou fluorochrómom značenej protilátky.

3. Cytopathos, spol. s r.o. 01.01.2010 – 31.08.2010 Podiel ochorení tráviacej sústavy v biopsií Podiel špecifických a nešpecifických zápalových ochorení čreva na všetkých ochorenia tráviacej sústavy

4. Chronické zápalové ochorenia neurčitej etiológie sú vysoko komplexné a úzko integrované zahrňujúce väzby: • genetické • environmentálne • neuroendokrinné

5. IBD je chronické ochorenie čreva neznámej etiológie zahrňujúce dve hlavné entity : Ulcerózna kolitída (UC)‏ Crohnová choroba (CD)‏

6. Diagnostika IBD a diferenciácia medzi CD a UC sú založené na kombinácii výsledkov: • klinických prejavov • laboratórnej diagnostiky • radiológie • endoskopie • histopatológie • serológie 10 – 17 % pacientov nedeterminovaná kolitída (IC).

7. Zhonghui Wen., Claudio Fiocchi: Inflamatory bowel disease: Autoimmune or immune-mediated pathogenesis Clin. Develop. Immunology., 9/10, 2004, Vol. 11(3/4), pp195-204. IMUNITOU OVPLYVNENÝ AUTOIMUNITNÝ • Prítomnosť protilátok a autoprotilátok (ASCA, ANCA, cirkulujúci komplement fixačný faktor, anti-F(ab)2, a iné), potenciálne autoantigény (hTM5, IFP, kardiolipin, pankreatický proteín a iné), aktivovaný komplement, mikrocievach mukózy, črevnom epiteli v spojení s IgG1 protilátkami, neboli nájdené orgánovo – špecifické protilátky. • Nerovnováha Th1/Th2 lymfocytov, Th1 odpoveď s vysokou produkciou IL-12, IL-18, a interferon-γ pri CD, Th2 odpoveď CD1d-restricted NK T bunkami s vysokou produkciou IL-13 pri UC aktivácia dendritických buniek, Črevná flóra „No bacteria, no colitis“

8. Autoprotilátky pri IBD • ANCA (NSA) – neutrophil – specific antibodies • ASCA – Anti Saccharomyces ceravisiae antibodies • AGCA (GAB) – Anti goblet cells antibodies • APACA (AICA) - Anti pancreas acinus cell antibodies • AhTMA – anti human tropomyosin antibodies AECA (AEndA) – Anti endothelial cells antibodies ANA - anti nuclear antibodies

9. pANCA (NSA) neutrophil – specific antibodies atyp. pANCA cANCA Hlavné autoantigény asociované s UC sú lokalizované na periférii jadier neutrofilov. NSA väčšinou nereagujú s azurofílnymi granulárnymi komponentami PR3 a MPO. Pacienti s UC, ktorí majú zároveň PSC - frekvencia NSA takmer 85 %. Pacienti s UC bez súčasnej PSC - frekvencia NSA je okolo 15 %. Takmer 50 %pacientov nedeterminovanou kolitídou nemá ANCA ani ASCA protilátky. Budúce štúdie by mali objasniť, či táto skupina pacientov nereprezentuje samostatnú klinickú entitu.

10. Orgánovo – špecifické autoprotilátky Vybrané autoimunitné ochorenia a asociovane protilátky (upravené) zdroj: EUROIMMUN

12. AGCA (GAB)Anti goblet cells antibodies AUTOANTIGÉN V roku 1959 Broberger a Perlmann autoprotilátky proti zložkám mucínu produkovaného črevnými GC Metódou voľby pre dôkaz AGCA je nepriama IFL metóda na nefixovanom ľudskom fetálnom čreve skupiny „0“. Fetálne črevo eliminuje nešpecifickú reakciu proti bakterialným a potravinovým antigénom. V pozitívnych prípadoch sú AGCA viditeľné v epitelových bunkách sliznice čreva. Testy môžeme vykonávať aj na bukových kultúrach adenokarcinómu hr. čreva línia HT29-18-N2, ktoré diferencijú do mucin produkujúcich buniek.

13. AGCA (GAB)Anti goblet cells antibodies HT29-18-N2 Goblet cells majú makro aj mikroskopicky rovnakú lokalizáciu ako ochorenie. V tenkom čreve sú menej časté, ale jedna vedľa druhej v hrubom čreve smerom k rektu. Najvyšší výskyt pohárikovitých buniek je v kryptách. Deplécia GC je charakteristickejším znakom pri UC ako pri CD. Doposiaľ nie je jasné čí AGCA majú primárnu alebo sekundárnu úlohu v patogenéze UC. Sú AGCA jednoducho epifenoménom spojeným s T-ly riadenou deštrukciou GC? Primárny efekt je oveľa pravdepodobnejší, pretože AGCA majú nízky výskyt u pacientov s rozvinutou aktívnou formou UC. Sekundárny efekt môže spočívať v porušení funkcie mucínu ako ochrannej bariery.

14. Vi Ak TM CK Tropomyozín AhTM5 Tropomyozíny sú IFP nájdeme vo všetkých eukaryotických bunkách a sú asociované s aktínom. Nárast protilátok bol zaznamenaný pri UC, RA, SS Popísaných je 5 izoform hTM1 – 5 izoformy hTM1, hTM2 a hTM3 sa vyskytujú hlavne v hladkej svalovine tenkého čreva a v stenách ciev nie však v epiteli. izoforma hTM4 je lokalizovaná v bunkách endotelu a bazálnej membráne epitelu hrubého čreva

15. Tropomyozín AhTM5 AhTM5 sú špecifické IgG protilátky v sére pacientov s UC, ktoré indukujú vznik C3b depozít a deštruujú epitel čreva. IF test 79 % senzit., 100 % špecifitu • hTM5 je predominantná izoforma epitelu hrubého čreva a niektorých extraintestinálnych orgánov • nevyskytuje sa v epiteli tenkého čreva, a ezofágu, žlčových kanálikoch • silno reaguje s epitelom kože, extrahepatálnych žlčovodov, veľkých interlobárnych duktoch a s epitelom močového mechúra.

16. ASCA 10 % ASCA AGCA pANCA/NSA 28 % 83 % 76 % 4 % 6 % 2 % 13 % 0 % 1 % IgM IgG darcovi krvi IgA 2 % AICA AGCA pANCA 8 % 69 % 23 % 3 % 58 % 39 % IgG IgG IgA IgA hTM5 64% asociovaný s aktivitou ochorenia ULCERATÍVNA KOLITÍDA

17. APACA (AICA)pancreas acinus cell antibodies AICA môžu mať význam pri vyhľadávaní pacientov so skorým alebo stredným stupňom CD. AICA protilátky neboli nájdené ani u jedného pacienta s UC resp. negat. kontrol. Protilátky proti sekréčnym komponentom pankreasu sú pravdepodobne epifenoménom , ktorý môže byť spôsobený krížovou reakciou s iným antigénom napr. bakteriálneho pôvodu a sú zodpovedné za spustenie a udržanie zápalu čreva s adjuvantným efektom v dôsledku čoho sú pacienti silno imunizovaní proti baktériam črevnej flóry.

18. Typ II. Typ I. APACA (AICA)pancreas acinus cell antibodies Drop-like staining Speckled staining • obidva typy sú špecifické pre CD • vyskytujú sa aj u prvostupňových príbuzných pacientov s IBD Seibold, F., Scheurlen, M., Muller, A. et al. Impaired pancreatic function in patients with Crohns disease with and without pancreatic abnormalities. J Clin Gastroenterology, 1996, 22(3), 202-206. Seibold, F., Mork, H., Tanza, S.et al.: Pankreatic autoantibodies in Crohns disease: a family study. Gut, 1997, 40, 481-484.

19. ASCASaccharomyces ceravisiae ASCA protilátky sú namierené proti zbytkom manózy polysacharidu mannan v bunkovej stene kvasiniek Saccharomyces cerevisiae. Objavujú sa tiež žvýšené hodnoty protilátok proti pektínu a iným polysacharidom. ASCA je skôr asociovaná s ťažkým ochorením tenkého čreva, s penetráciou CD a môže byť diagnostikovaná aj roky pred manifestáciou klinických prejavov.

20. AICA AICA ASCA 9 % 55 % 36 % 8 % 2 % 39 % 80 % 67 % 6 % 0 % 2 % IgA IgG 2 % 7 % pANCA/NSA 26 % 31 % 55 % 14 % IgG IgA IgM darcovia krvi CROHNOVA CHOROBA ASCA

21. Anti-glykanové protilátky nové možnosti diagnostiky IBD. anti-laminaribiosid carbohydrat – IgG (ALamCA) S.c. anti-mannobiosid cyrbohydrat – IgG (AManCA) S.c. anti-chitobiosid carbohydrat – IgA (AChiCA)‏ 44 % ASCA negatívnych sér pacientov s CD obsahuje ALamCA, alebo AChiCA. Pacienti s IBD s pozitivitou protilátok ALamCA, AChiCA, alebo ASCA mali CD so senzitivitou 77,4 %a špecifitou 90,6 %. Pri pozitívite najmenej dvoch týchto protilátok sa špecifita zvýši na 99,1 %.

22. Ďakujeme za pozornosť