Métodos aplicados para  -caroteno

1. Universidad de Chile Facultad de Ciencias Químicas y Farmacéuticas Dpto. Ciencia de los Alimentos y Tecnología Química Química de Alimentos y Materias Grasas Métodos aplicados para -caroteno Dra. Paz Robert C. Taller FAO, 2008

2. Estructura básica • Tetraterpeno de 40 carbonos, simétrico y lineal formado a partir de 8 unidades isoprenoides de 5 C unidas de manera tal que el orden se invierte en el centro. • Amplio sistema de doble enlace conjugado.

3. Análisis de Carotenoides Dependiendo del grado de información deseado -caroteno Provitamina A Composición completa Provitamina A Carotenos principales

5. Características espectrales Espectro de absorción de carotenoides son dependientes del solvente 1%A1cm usado en el cálculo de la concentración también varía marcadamente con el solvente Carotenoides en solución obedecen la Ley de Lambert-Beer. Su absorbancia es directamente proporcional a la concentración. Britton, 1995; Rodriguez-Amaya. 2001

6. POSIBLE ESQUEMA DE DEGRADACIÓN DE CAROTENOS Moléculas altamente insaturadas TRANS CAROTENO isomerización oxidación EPOXICAROTENOS APOCAROTENOS CIS-CAROTENOS oxidación Pérdida de color Pérdida valor nutritivo Pérdida de sabor COMPUESTOS DE BAJO PESO MOLECULAR

7. ... Isomerización cis • causa leve pérdida de color, disminución de 2 a 6 nm en la , aparición de un pick en la región UV Licopeno trans 15-cis 13-cis

8. Procedimiento Analítico • Muestreo y preparación de la muestra • Extracción con acetona en frio • Transferencia (partición) a éter de petróleo, hexano, eter etílico • Saponificación y lavado • Concentración en evaporador rotatorio (<35°C) • Separación cromatográfica • Identificación y cuantificación.

9. Muestreo y preparación de la muestra. • Homogenización de la materia prima • Extracción con acetona en frío

10. Partición a éter de petróleo

11. Separación OCC FM: porcentajes crecientes de acetona en éter de petróleo MgO : Celite (1:1) Espectro de absorción UV/VIS, Rf, orden de elución cromatográfica reacciones específicas.

12. Fases Estacionarias-OCC • Alúmina • Sílica • CaCO3 • Ca(OH)2 • MgO • ZnCO3 • Tierras silíceas (tierra de diatomeas, kieselguhr, hyflosupercel) • Celulosa, almidón, dextrancross-linked (sephadex), Polietilen • Mezclas de ellos Rodriguea-Amaya, 2001

13. Criterios de identificación OCC Espectro de absorción UV-Vis de acuerdo con el cromóforo sugerido Propiedades cromatográficas concordantes en dos sistemas diferentes. Orden de salida OCC y Rf(TLC). • Estructura fina del espectro (%III / II)*100 Britton, 1995

14. Espectro de absorción max • zeinoxantina 421 445 474 • -criptoxantina 421 445 475 • Luteina 421 445 475

15. Espectro de absorción max • -criptoxantina (425) 449 476 • zeaxantina (424) 449 476

16. Métodos Oficiales AOAC • Carotenos en plantas frescas Ch-45 (941.15) /método espectrofotométrico. • Carotenos y xantofilas en plantas secas y alimentos mezclados Ch-45 (970.64)/ método espectrofotométrico • Carotenos y carotenoides en productos de macaroni Ch-32 (938.04) • Carotenos y carotenoides en huevos Ch-32 (938.04)

17. Carotenos en plantas frescas • Pigmentos solubles en grasa, extraídos y cromatografiados para remover clorofilas e hidroxicarotenos, los cuales son determinados espectrofotométricamente y expresados como beta-caroteno MgO:hyflosupersel (1:1)

18. Carotenos y xantofilas en plantas secas y alimentos mezclados Silica gel G+hyflosupersel (1:1) MgO:hyflosupersel (1:1)

19. Separación-HPLC Fase inversa-Fases enlazadas RP-18 ó C18 RP-8 ó C8 C-30 Ntrilo, amino Fase Inversa-HPLC Columnas enlazadas RP-18: Aplicable a carotenoides de todos los niveles de polaridad. Materiales RP son inertes, formación de artefactos es mínima. Se puede trabajar en elusión con gradiente

20. Separación-HPLC Fase Normal Ca(OH)2 Alúmina Sílice Fase Normal • Sílice compuestos son eluídos de acuerdo a su polaridad, útil para separación de xantofilas, los carotenos son pobremente resueltos • Alúmina, Ca(OH)2 Para algunas separaciones especiales. Presentan dificultades prácticas: tienen una vida corta y necesitan un control riguroso de humedad

21. Criterios de identificación-HPLC Tiempos de retención tr Tiempo de retención relativo TRR = tr,i / tr,st Adición a la muestra del componente supuesto: normalmente se agrega a la muestra, el supuesto componente i y se ve cual pico crece. Correlaciones gráficas de estructura -retención

22. Criterios de identificación HPLC Espectro de absorción UV-Vis de acuerdo con el cromóforo sugerido Propiedades cromatográficas concordantes en dos sistemas diferentes. Espectro de masas que confirme por lo menos la masa molecular.

23. Cuantificación Curva de calibración  Comparación con muestras de concentración conocida Cs/Cst = As/Ast • Standard Interno Fi (Ci/Cst) = (Ast/Ai)

24. Rosa mosqueta (Rosa Rubiginosa) Características espectrales de carotenoides identificados Fracción Fase movil Identificación Rf** Máx long de onda Máx long de onda Literatura* 1 5% acetona (426) 448 476 B-Caroteno 0,98 (425) 450 477 2 10% acetona (422) 444 472 Zeinoxantina 0,43 421 445 475 3 20%acetona 450 Apocarotenal prob. 0,98 4 30-40% acetona (424) 442 468 Anteroxantina prob 0,19 (422) 445 472 5 60% acetona (422) 442 472 Luteína 0,19 (421) 445 474 zeaxantina (424) 449 476 6 100% acetona 432 458 488 Rubixantina 0,52 434 460 490 7 10% agua-acetona 442 468 500 Licopeno 0,98 444 470 502 * Davies, 1976; Rodriguez-Amaya, 1999 ** Placa de sílice, FM metanol 5% en benceno

25. HPLC (Rosa Mosqueta) Rubixantina Licopeno -caroteno Columna: RP-18 symmetry, 5u, 250 mm Fase móvil: acetonitrilo: metanol: acetato de etilo (65: 20: 15) Flujo: 1ml/min

26. Zanahoria Tomate Identificación por Trr con patrones extraídos.