Blutgruppen pcr lohnt sich der aufwand
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Blutgruppen-PCR Lohnt sich der Aufwand?. Dr. med. Guido Heymann Zentrale Abteilung für Laboratoriumsmedizin DRK-Kliniken Berlin. Themen. Molekulargenetische Methodik Verfügbare Systeme Indikationen Beispiele AB0 Rhesus MNS Kosten und Aufwand Fazit. Ziel der PCR-Untersuchung.

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Blutgruppen-PCR Lohnt sich der Aufwand?

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Presentation Transcript


Blutgruppen pcr lohnt sich der aufwand

Blutgruppen-PCRLohnt sich der Aufwand?

Dr. med. Guido Heymann

Zentrale Abteilung für Laboratoriumsmedizin

DRK-Kliniken Berlin


Themen

Themen..

  • Molekulargenetische Methodik

  • Verfügbare Systeme

  • Indikationen

  • Beispiele

    • AB0

    • Rhesus

    • MNS

  • Kosten und Aufwand

  • Fazit

Blutgruppen-PCR Lohnt sich der Aufwand?


Grundlagen

Ziel der PCR-Untersuchung

Ziel der Serologie

Grundlagen

Protein

chromosome

RNA

Zellkern

Doppelsträngiges DNA Molekül

Zellkern

RNA

Individual nucleotides

Blutgruppen-PCR Lohnt sich der Aufwand?


Molekulargenetische methodik

5’

3’

5’

3’

DNA-Vorlage (Template)

3’

5’

3’

5’

Stränge werden getrennt Denaturierung

Forward primer

5’

3’

3’

5’

5’

3’

5’

3’

Verlängerung (Extension)

Reverse primer

Anlagerung Primer (anneal)

Molekulargenetische Methodik

  • DNA-Vervielfältigung durch Polymerase-Kettenreaktion

Blutgruppen-PCR Lohnt sich der Aufwand?


Molekulargenetische methodik1

Original-DNA Zielregion

Thermal cycle

Thermal cycle

Thermal cycle

Molekulargenetische Methodik

  • DNA-Vervielfältigung erfolgt Exponentiell

1,07*109 Kopien der Zielregion werden bei 100% Effizienz in ca. 32 Zyklen erzeugt.

Blutgruppen-PCR Lohnt sich der Aufwand?


Molekulargenetische methodik2

Molekulargenetische Methodik

  • Amplifikatdarstellung

Blutgruppen-PCR Lohnt sich der Aufwand?


Molekulargenetische methodik3

Detektor

Fenster

Molekulargenetische Methodik

  • Amplifikat wird in die Kapillare injiziert

  • Sequenzierung

  • Spannung wird angelegt

  • Amplifikate wandern zur Anode

  • Amplifikattrennung durch Länge:Große Stränge wandern langsamer durch das Gel

  • Farbfluoreszenz der endständigen Base wird detektiert

Blutgruppen-PCR Lohnt sich der Aufwand?


Molekulargenetische methodik4

Molekulargenetische Methodik

  • weitere eingesetzte Verfahren

    • Restriktionsfragment-Längenpolymorphismen (RFLP)

    • PCR-SSO (sequenzspezifische Oligonukleotide)

    • Real-time-Verfahren

    • Schmelzkurvenanalyse

Blutgruppen-PCR Lohnt sich der Aufwand?


Vorschriften

Vorschriften

  • Richtlinien:Abschnitt 4.2.5„Die Wahl des Untersuchungsverfahrens ist unter Berücksichtigung des aktuellen Wissensstandes zu treffen.“MPG, QualitätssicherungRingversuch (INSTAND): AB0, Rhesus, Kell, Duffy, Kidd, MNSKontrollen, „Testreagenzien“

Blutgruppen-PCR Lohnt sich der Aufwand?


Verf gbare testsysteme

Verfügbare Testsysteme

  • sonstwie durchgeführt:

    • McCoy

    • Chido,Rodgers

    • Js(ab)

    • Lewis

    • Xg

    • Landsteiner-Wiener

    • Gerbich

    • Cromer

    • Ii

    • XK, Js(ab)

    • Scianna

    • T/Tn

    • P-Globoside

    • H/h

    • Indian

    • GIL, JMH, OK, RAPH

  • Kommerziell erhältlich:

    • AB0

    • Rhesus

    • Kell, (Kk, Kp(ab))

    • Kidd

    • MNS

    • Duffy

    • Lutheran

    • Cartwright (Yt)

    • Colton (Co)

    • Knops

    • Wright, Diego (Di)

    • Dombrock (Do)

bisher nicht testbar (z.B.):

Vel

Lan

Blutgruppen-PCR Lohnt sich der Aufwand?


Verf gbare testsysteme eigene tests

Verfügbare Testsysteme: eigene Tests

  • Interessante Web-Seiten zum Thema:

    • The Blood Group Antigen Gene Mutation Database:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/mhc/xslcgi.fcgi?cmd=bgmut/home

    • Rhesusbase:http://www.uni-ulm.de/~fwagner/RH/RB/

    • NCBI Entrez Nucleotidehttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/

Blutgruppen-PCR Lohnt sich der Aufwand?


Indikationen

Indikationen

  • wissenschaftliche Fragestellungen

  • Zur Ergänzung von nicht eindeutigen serologischen Ergebnissen

  • Wenn keine serologischen Untersuchungen möglich sind:

    • unsichere Antigenbestimmung bei Vortransfusion, Polyagglutinationsphänomen oder z.B. AIHA

    • Bestimmung erythrozytärer Merkmale aus fetalen Materialien

    • genetische Disposition bei Risikoschwangerschaften

    • Untersuchung nach KMT, bei Chimärismus

  • forensische Fragestellungen

    • Vaterschaftsbegutachtung

    • kriminalistische Zuordnung von Spuren zu Tätern

Blutgruppen-PCR Lohnt sich der Aufwand?


Beispiele ab0

Beispiele: AB0

  • Das Gen für die AB0-Transferasen liegt an Position 9q34.1-9q34.2

  • Es kodiert für ein Enzym, das endständige Zucker an eine Grundsubstanz (H) anhängt

  • Aminosäurevarianten verursachen:

    • geringere Transferaseaktivität

    • Spezifitätswechsel des endständigen Zuckers

Blutgruppen-PCR Lohnt sich der Aufwand?


Beispiele ab01

Beispiele: AB0

Aktuell sind 168 Allele beschrieben (A 57, B 40, 0 66 + besondere 5)

# Deletion eines Nukleotids erzeugt Frameshiftmutation mit zusätzlich 21 AS

Blutgruppen-PCR Lohnt sich der Aufwand?


Beispiele ab02

Beispiele: AB0

  • Probleme der AB0-Typisierung:

  • Es existiert keine klare Vergleichbarkeit zwischen dem Allel und der serologischen Reaktion.

  • Die Wertigkeit (Auswirkungsstärke) der spezifischen Aminosäuren an speziellen Positionen ist nicht klar (z.B. B-Transferase weil Ala268 oder Gly176, nondeletionales 0-Allel).

  • Letzter Ausschluß von A101 nur durch Fehlen von Missense- oder Nonsensemutation in den Exonen 1 bis 7 (Sequenzierung).

  • Transfusionsrelevanz ?!

Blutgruppen-PCR Lohnt sich der Aufwand?


Beispiele rhesus

Beispiele: Rhesus

  • günstige Situation: nicht glycosyliertes Membranprotein

  • Testmöglichkeiten:

    • RhD, C,c,E,e,Cw..

    • schwaches D: Dweak oder D partial

    • D-Zygotiebestimmung

    • CE-Haplotypbestimmung

Blutgruppen-PCR Lohnt sich der Aufwand?


Beispiele rhesus1

Beispiele: Rhesus

Blutgruppen-PCR Lohnt sich der Aufwand?


Beispiele rhesus2

Beispiele: Rhesus

Blutgruppen-PCR Lohnt sich der Aufwand?


Beispiele rhesus3

Beispiele: Rhesus

Blutgruppen-PCR Lohnt sich der Aufwand?


Beispiele rhesus4

Beispiele: Rhesus

  • Probleme der Rhesus-Typisierung:

  • „PCR-positiv Serologie-negativ“ durch seltene Basenmutationen, die D (oder auch CE) unterdrücken.

  • Was wird kodiert – was wird exprimiert?

  • c (Cyt 48) -> Intron 4 Testung für C

  • bisher >170 Allele allein im D-Gen und 53 verschiedene Dweak beschrieben -> Sequenzierung

Blutgruppen-PCR Lohnt sich der Aufwand?


Beispiele mns

X-Over

NH2

Ser/Leu1SerThr

Thr

Gly/Glu5

Leu1SerThr

Thr

Glu5

´N´

1

M

N

1

29

Met/Thr

S s

72

COOH

COOH

131

GpA

Beispiele: MNS

  • Sialoglycoprotein

  • Glycophorin A (MN) und B (Ss)

  • Ausgeprägte Homologien zwischen GpA, GpB und GpE in den ersten Exonen. Gene entwickelten sich durch Duplikation aus GpAPNAS, 1989, 86, 4619ff

  • Nur wenige Basenaustausche unterscheiden M und N (5 in In1, Ex2 und In2) und S und s (1 in Ex4).

Exon1 Exon2 Exon 3 Exon 4 Exon 5 Exon 6 3´-UT

NH2

324 395 1822

-28 2 15 227 377 1733

GpA

G

T

GpB

x

x

C

T

Proteinstart

GpE

GpB

Homologe Region

Blutgruppen-PCR Lohnt sich der Aufwand?


Beispiele mns1

Beispiele: MNS

  • Probleme der MNS-Typisierung

  • Protokolle zeigen Schwächen:

    • unterschiedliche Annealing-Temperaturen für M und N benötigtTransfusion, 1993, 33, 119ff

    • sehr lange AmplifikateAmplitype PE

    • Ausfälle bei spezifischen Allelen In J Legal Med, 1996, 109, 216f

PhänotypalterHybrid

Name

GP.VwMi.IA-B-A

GP.MurMi.IIIB-A-BS

GP.BunMi.VIB-A-B

GP.HFMi.XB-A-B

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Beispiele mns2

Beispiele: MNS

  • Probleme der MNS-Typisierung: Fall

  • Patientin E.K. 21 Jahre

  • Ak-Differenzierung: Anti-S, EA –

  • PCR: NNSs

  • Serologie: ss

  • Hybridmolekül; AS-Variante, die spezifisches Epitop für Ak zerstört?

  • Sequenzierung….

M M M N N M S s

Blutgruppen-PCR Lohnt sich der Aufwand?


Weitere probleme der bg pcr

weitere Probleme der BG-PCR:

  • das Genprodukt erzeugt nicht direkt den Phänotyp, sondern ein umwandelndes Enzym:z.B. Lewis, P1, Ii

  • Ringversuche, Qualitätskontrolle

  • Kontrollproben (positiv und negativ)

  • Inhibitoren: z. B. Kidd, Lutheran…

  • seltene Allele: z. B. Rhesus D, FyX…

Blutgruppen-PCR Lohnt sich der Aufwand?


Kosten und aufwand

Kosten und Aufwand

  • SerologiePCR-SSPSequenzierung

  • Aufwand + ++ +++

  • Zeit + (ca. 45 Min) ++ (ca. 2 h) +++ (ca. 4h)

  • Kosten (AB0) ca. 4-5 €ca. 7-20 € (inhouse) ca. 40-50 €ca. 30 € (kommerziell)

  • GOÄ (AB0)3980 5,83 €3920 52,46 € 3920 52,46 € (3981 10,49 €)3922 29,14 € 3926 116,57 €

  • Thermocycler zwischen 3000-7000 €

  • Photoanlage ca. 2000 €

  • Gelkammer, Spannungsgerät ca. 700 €

  • Sequencer ca. 30.000 bis 100.000 €

Blutgruppen-PCR Lohnt sich der Aufwand?


Fazit blutgruppen pcr lohnt sich der aufwand

Fazit: Blutgruppen-PCR Lohnt sich der Aufwand?

Jein

  • wenn PCR-Austattung für andere Anwendungen vorhanden ist und/oder eine nennenswerte Anzahl von Problemfällen auftritt

  • „Zukunftstechnologie“: Erfahrungen mit molekulargenetischer Diagnostik sammeln

  • Kein Ersatz für Serologie

Blutgruppen-PCR Lohnt sich der Aufwand?


Blutgruppen pcr lohnt sich der aufwand

Blutgruppen-PCR Lohnt sich der Aufwand?


Interessante publikationen

interessante Publikationen:

  • AB0:

    • Systematic analysis of the AB0 gene diversity within exons 6 and 7 by PCR screening reveals new AB0 allels. A. Seltsam et al. Transfusion 2003, 43; 428ff

    • Single tube multiplex PCR-SSCP analysis distinguishes 7 common AB0 alleles and readily identifies new alleles. S. Yip Blood 2000, 95/4; 1487ff

    • Molecular genetics of the AB0 histo-blood group system. F. Yamamoto Vox sanguinis 1995, 69; 1ff (Fortsetzung in anderen Ausgaben)

    • Amplified product lenghth polymorphism (AFLP): a novel strategy for genotyping the AB0 blood group. G. Watanabe Human Genetics 1997, 99; 34ff

    • Polymorphisms at the AB0 locus in subgroup A individuals. M.L. Olsson Transfusion 1996, 36; 309ff

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Interessante publikationen1

interessante Publikationen:

  • Rhesus:

    • RHD/CE typing by polymerase chain reaction using sequence-specific primers. C. Gassner et. al. Transfusion 1997; Vol 37;1020ff

    • Genetik des Rhesus-Blutgruppensystems. W.A.Flegel Deutsches Ärzteblatt 2007, 10; 573ff

    • The Rh blood group system: a review. N. Avent, M. Reid Blood 2000, 95/2; 375ff

    • Testing for the D zygosity with three different methods revealed altered rhesus-boxes and a new wek D type. P. Perco et al. Transfusion 2003, 43; 335ff

    • Molecular basis of weak D phenotypes. F. Wagner et al. Blood 1999, 93/1; 385ff

    • RHD positive haplotypes in D negative europeans. F. Wagner et al. BMC Genetics 2001, 2; 10ff

    • RHD gene deletion occured in the Rhesus box. F. Wagner, A. Flegel Blood 2000, 95/12; 3662ff

Blutgruppen-PCR Lohnt sich der Aufwand?


Interessante publikationen2

interessante Publikationen:

  • weiteres:

    • Differentiation of autologous ABO, RHD, RHCE, KEL, JK, and FY blood group genotypes by analysis of peripheral blood samples of patients who have recently received multiple transfusions. P. Rozman et al. Transfusion 2000, 40; 936ff

    • Molekulargenetische Blutgruppendiagnostik. T. Müller et.al. Deutsches Ärzteblatt 2001, 98/6; 317ff

    • DNA analysis for the Dombrock polymorphism. M. Rios et al. Transfusion 2001, 41; 1143ff

    • Quantitative Alleles of CR1: Coding sequence analysis and comparison of haplotypes in two ethnic groups. L. Xiang J. Immunology 1999, 163; 4939ff

    • The low-incidence MNS antigens Mv, sD, and Mit arise from single amino acid substitutions on GPB. J. Storry et al. Immunohematology 2001, 41; 269ff

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