Všeobecné vybavenie molekulárneho laboratória

1. Všeobecnévybavenie molekulárneho laboratória Chemické sklo (skúmavky, odmerné valce, kadičky, Erlenmeyerove banky, reagenčné fľaše a iné) – používajú sa pri príprave roztokov, gélov, kultivačných médií, ako aj na ich uskladnenie - v rámci experimentov v molekulárnom laboratóriu sa sklené nádoby využívajú v oveľa menšej miere ako v chemickom laboratóriu, pretože sú nahradené kvalitnými sterilnými plastovými nádobami vo váčšine prípadov na jednorázové použitie Plastové nádoby a pomôcky Experimenty v molekulárnej biológii si vyžadujú prácu v sterilných podmienkach so sterilnými pomôckami. Na zabránenie kontaminácie – jednorázový materiál vyrobený z kvalitného plastu (napr. polypropylén), vysoká odolnosť voči chemikáliám a vysokým teplotám, väčšinu z nich je možné sterilizovať alebo autoklávovať

2. Skúmavky so šróbovacím uzáverom Mikroskúmavky (tzv. eppendorfky) • rôzne objemy – 2,0 ml; 1,5ml; 0,5 ml; 0,2 ml (pri metóde PCR) • uzatvárateľné rôznymi typmi uzáverov • prispôsobené pre centrifugáciu v rôznych typoch centrifúg

3. PCR Strip Tubes PCR Tubes PCR plate (PCR plát)

4. Špičky s filtrom Špičky na mikropipety • rôzny objem podľa použitej mikropipety (objem 1000, 200, 10 l) • podľa objemu sú špičky aj farebne odlišné (modré 1000l, žlté 200l, biele-bezfarebné 10l) • vzhľadom na odlišnosť mikropipiet od rôznych výrobcov, je potrebné použiť špičky určené pre konkrétny typ mikropipety • Vyrobené z kvalitného plastu, sú odolné voči chemikáliám a je možné ich sterilizovať a autoklávovať

5. Mikropipety Mechanické pipety s fixným a variabilným objemom Jednokanálové, Viackanálové • fixné pipety s objemom od 10 µl až do 1 000 µl, pipety s variabilným objemom 0,1 µl - 2,5 µl až po 1 - 10 ml   • 8-kanálové a 12-kanálové pipety o objemoch 0,5 - 10 µl, 10 - 100 µl a 30 - 300 µl   • Autoklávovateľné, buď celá pipeta alebo len jej spodná časť • pipety s variabilným objemom - nastaviteľné pomocou otočnej skrutky • separátny vyhadzovač 

6. Elektronické pipety • 1-kanálové, 8-kanálové nebo 12 kanálové                                    • zobrazovací displej • pracovné režimy: pipetovanie, opakované dávkovanie – nasaje plný objem špičky a dávkuje užívateľom nastavený objem, možnosť premiešania vzorky po vypustení do skúmavky, nastaviteľná rýchlosť nasávánia i vypúšťania • možnosť pripojenia k PC a vytvorenia vlastných pracovných režimov pomocou ovládacieho softwéru

7. Zásady pipetovania • Nenastaviť objem pod 0l alebo nad maximálny objem mikropipety, inak dochádza k jej poškodeniu a chybe merania • Kvapalina sa pri pipetovaní prenáša v plastovej špičke (Nikdy nezabudnúť ju nasadiť!!!, inak skontaminujeme alebo poškodíme piest pipety) • Nasávanie a vypúšťanie realizujeme stláčaním a uvoľnením piestu pipety – piest stlačíme do prvej polohy a špičku ponoríme do kvapaliny, uvoľnením uvedieme piest do pokojovej polohy za súčasného naberania kvapaliny do špičky (ubezpečíme sa, že v kvapaline v špičke nie sú vzduchové bubliny), pipetu so špičkou vyberieme a vložíme do novej skúmavky, kde vypustíme celý obsah špičky stlačením piestu Pozor! Kapilárne javy v špičke spôsobia, že sa celý objem kvapaliny nevytlačí, preto stlačíme piest až na doraz (do druhej polohy) • Špičku z pipety odstránime použitím „vyhadzovača“ • Špičku vždy meníme!!! – je jednorázová

8. Centrifugácia • Separačná metóda založená na rozdielnom pohybe častíc v tekutom prostredí vplyvom odstredivej sily • Odstredivé pole vzniká otáčaním rotora centrifúgy, pohyb častíc je podmienený hmotnosťou a prostredím • Využíva sa napr. pri izolácii, purifikácii (prečisťovaní) DNA, RNA a proteínov • Rýchlosť centrifugácie závisí od veľkosti častíc, ktoré separujeme a od metódy, vyjadruje sa pomocou jednotky otáčky za minútu (ot/min., rpm) 2 typy centrifugácie : Diferenciálna (frakčná) – je možné oddeliť zmes častíc, ktoré sa výrazne líšia veľkosťou, hmotnosťou alebo hustotou. Prebieha v homogénnom roztoku. Zložky zmesi sedimentujú rôznou rýchlosťou. Častice s najväčšou hmotnosťou alebo veľkosťou po centrifugácii vytvoria zónu na dne skúmavky, ďalšie častice tvoria ďalšie zóny smerom k ústiu skúmavky podľa klesajúcej hmotnosti. Využitie – na separáciu a izoláciu zložiek lyzátov z buniek.

9. Zonálna (gradientová) – používa sa, ak zmes na separáciu pozostáva z častíc, ktorých rýchlosť sedimentácie je veľmi podobná (rôzne typy nukleových kyselín). Používa sa gradientový roztok (sacharóza, CsCl), ktorého koncentrácia od povrchu ku dnu skúmavky stúpa. Čistota preparátov je vysoká. Zásady centrifugácie : • skúmavky v rotore musia byť vyvážené – vždy umiestňujeme skúmavky s rovnakou hmotnosťou oproti sebe • Manipuláciu so skúmavkami v centrifúge uskutočňujeme len vtedy, ak nie je centrifúga v činnosti • Centrifugáciu spustíme až vtedy, keď je veko centrifúgy bezpečne zatvorené; veko otvoríme až po zastavení rotora • Používame len skúmavky odporúčané výrobcom centrifúgy

10. Rôzne typy centrifúg s rôznymi rotormi

11. Typ rotora centrifúgy

12. Sterilizáciapomôcoka priestorov Pri práci s NK je riziko kontaminácie veľmi vysoké, môže dôjsť ku kontaminácii vzoriek cudzorodou DNA (napr. pri práci s ľudskou DNA je možná kontaminácia s DNA experimentátora) alebo sa kontaminujú vzorky navzájom. Zvlášť vysoké riziko nastáva počas metódy PCR. Opatrenia: jednorázový materiál, sterilizácia priestorov a materiálu, ochranný odev • použitie UV svetla– degraduje molekuly NK a eliminuje prítomné baktérie (špeciálne boxy s UV lampou a laminárnym prúdením vzduchu – pri otvorení boxu zabraňuje výmene vzduchu medzi boxom a okolím) • pomocou autoklávu – sterilizácia sa dosahuje pôsobením nasýtenej vodnej pary pri vysokej teplote a tlaku (najčastejšie pri 120°C, pri tlaku 0,1-0,3 MPa, 20 min.) (plasty, sklo), je možné autoklávovať aj roztoky (zásady- množstvo roztoku nesmie presiahnuť 2/3 objemu nádoby, vrchnák nádoby nechať nasadený len voľne • pomocou sterilizátora – pôsobením vysokej teploty, menej účinná ako sterilizácia v autokláve

13. Tlmivé roztoky (pufre, angl. buffers) • Udržujú pH roztoku konštantné aj po pridaní malého množstva kyselín alebo zásad • Ph tlmivého roztoku sa nemení ani zriedením roztoku • Využívajú sa pri práci s enzýmami, pri elektroforéze, izolácii a purifikácii biologicky aktívnych látok • tlmivé roztoky pre prácu s enzýmami majú rôzne zloženie, sú komerčne dodávané s konkrétnym enzýmom

14. IzoláciaDNA Cieľ: získať čistú, vysokomolekulárnu DNA bez proteínov a polysacharidov • vzhľadom na veľkosť DNA v jednotlivých chromozómoch eukaryotických organizmov (desiatky miliónov báz), je technicky veľmi náročné izolovať neporušené molekuly DNA v plnej dĺžke a manipulovať s nimi v in vitro podmienkach. • Pre väčšinu experimentov to však ani nie je potrebné a úplne postačujúca je fragmentovaná DNA s dĺžkou fragmentov 70-150 kb.

15. V súčasnosti existuje množstvo metodík izolácie nukleových kyselín z rôznych zdrojov. • Mnohí výrobcovia dodávajú celé súpravy chemikálií (tzv. kity) určené pre izoláciu DNA z konkrétneho zdroja s vysokou účinnosťou. • DNA sa izoluje z krvi, z chlpovej cibuľky, buniek sliznice ústnej dutiny, prípadne zo svalu alebo iných tkanív. • DNA z rastlinných pletív sa izoluje ťažšie v porovnaní so živočíšnymi tkanivami vďaka pevnej bunkovej stene. Na jej rozrušenie sa používajú rôzne zmesi enzýmov (izolované napr. z Trichoderma reesei) alebo sa bunková stena rozruší pomocou tekutého dusíka

16. Všetky metódy izolácie genómovej DNA z tkanív živočíchov a pletív rastlín sú založené na základných krokoch: • 1. homogenizácia (rozrušenie tkanív, pletív a čiastočne i buniek) • 2. lýza buniek a bunkových membrán • 3. uvoľnenie väzby medzi DNA a bielkovinou (rozpad nukleoproteínového komplexu) • 4. odstránenie proteínov a ostatných vysokomolekulárnych zložiek bunky okrem DNA, prečistenie DNA od nežiaducich prímesí (tzv. čistenie - purifikácia DNA) • 5. vyzrážanie DNA (precipitácia)

17. 1. rozrušenie tkanív v homogenizátore v prostredí zvoleného extrakčného média, v niektorých prípadoch – pri tkanivách s vysokou aktivitou nukleáz alebo pri pevnejších tkanivách (kostné tkanivo) – je vhodné tkanivo zmraziť v kvapalnom dusíku, rozdrviť na prášok 2. rozrušenie buniek (bunkových membrán) pomocou lyzačného roztoku (Tris- HCl pH=7.5, EDTA, aniónové detergenty – laurylsíran sodný, lítny alebo SDS (soľ dodecylsulfátu)) Aktivita nukleáz – enzýmov, ktoré sa prirodzene vyskytujú v bunkách a degradujú DNA sa inhibuje : • roztokom EDTA - viaže ióny (napríklad Mg2+), ktoré nukleázy vyžadujú ku svojej aktivite • teplotou až 60°C v prítomnosti detergentov (SDS)

18. 3. uvoľnenie väzby medzi DNA a bielkovinou DNA tvorí pevné komplexy s histónmi a ďalšími proteínmi, preto sa do lyzačného roztoku pridáva enzým proteináza K a detergenty (SDS alebo N-lauryl sarkozín), ktoré pomáhajú deproteinizácii (proteináza K - izolovaná z baktérie Tritirachium album - štiepi peptidové väzby po karboxylovej skupine N-substituovaných aminokyselín, čím hydrolyzuje proteíny)

19. 4. deproteinizácia preparátov DNA (odstránenie proteínov z roztoku) prečistenie preparátov DNA od bielkovinových prímesí sa dá uskutočniť viacerými postupmi, v ktorých použité činidlá denaturujú prítomné bielkoviny a DNA ostane rozpustená vo vodnej fáze bez toho, aby sa porušila ich štruktúra A) fenol alebo zmes fenol:chloroform- najefektívnejšie denaturačné činidlá. Nevýhodou fenolu je jeho vysoká toxicita. B) vysoľovanie pomocou NaCl

20. A) Nukleové kyseliny sú hydrofilné molekuly, ktoré sa dobre rozpúšťajú vo vodnej fáze. Bielkoviny vďaka prítomnosti hydrofóbnych skupín sú lepšie rozpustné v organickej vrstve (spodná). Po intenzívnom pretrepaní sa vzorka centrifuguje a vytvoria sa dve fázy. Vrchná vodná fáza obsahuje rozpustené nukleové kyseliny, medzifáza je tvorená denaturovanými proteínmi a zbytkami buniek, v hornej vodnej fáze je rozpustená DNA. Na odstránenie zvyškov fenolu sa využíva zmes chloroformu s izoamylalkoholom v pomere 24 : 1. Chloroform tiež denaturuje bielkoviny, izoamylalkohol znižuje penenie zmesi, uľahčuje oddelenie vrstiev pri centrifugácii a udržuje ich stabilitu. B) po centrifugácii získame v spodnej fáze tvorenej NaCl denaturované proteíny a v hornej vodnej fáze rozpustenú DNA 5. vyzrážanie DNA - najčastejšie 96% etanolom alebo izopropanolom - účinnému vyzrážaniu DNA sa pomáha znížením teploty a pridaním soli

22. IZOLÁCIA DNA POMOCOU KOLÓN Princíp metódy je založený na zachytení DNA na kolónkach, ktoré obsahujú silikagély alebo anióniontomeničové živice. Na izoláciu stačí 0,2 ml nezrazenej krvi. 1. Rozbitie buniek: proteináza K narušuje bunkové steny a napomáha rozrušenie buniek. Lyzačný roztok,obsahujúci chaotropné soli a detergent rozbíja otvorené bunky. Intenzívne premiešanie a teplota 65 °Cnapomáhajú lýze membrán a natráveniu bielkovín. 2. Zachytenie DNA na membráne kolónky: DNA sa viaže na kremičitú membránu kolónky, nežiadúcibunkový materiál, denaturované proteíny a RNA sa odstránia pretečením kolónkou. 3. Premývanie a odstránenie kontaminujúcich zložiek: Tlmivý roztok s etanolom odstráni nežiadúcebunkové zvyšky, soľné prímesi a zároveň vyčistí naviazanú DNA na kolónke. 4. Elúcia DNA z kolónky: podľa typu živice dosiahne sa alkalickým tlmivým roztokom alebo roztokoms vysokou koncentráciou soli. Výťažok býva cca 10 mg DNA/0,2 ml krvi.