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Western Blot 相关技术的 原理与操作 解放军总医院分子生物学研究室 宋海静

Western Blot 相关技术的 原理与操作 解放军总医院分子生物学研究室 宋海静. ◆ 实验目的 ● 掌握细胞总蛋白提取技术 ● 掌握 SDS- 聚丙烯酰胺凝胶电泳技术 ● 掌握蛋白质转印及抗体染色技术 ● 掌握 ECL 试剂的使用、 X- 片曝光及显影方法. 实验原理 ● 将获得的蛋白质样品通过 SDS- 聚丙烯酰胺凝胶电泳 [SDS-olyacrylamide gelelectrophoresis], 对不同分子量的蛋白质进行分离 ● 将分离到的蛋白质通过转移电泳方式转印至固

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Western Blot 相关技术的 原理与操作 解放军总医院分子生物学研究室 宋海静

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Presentation Transcript

  1. Western Blot 相关技术的 原理与操作 解放军总医院分子生物学研究室 宋海静

  2. ◆实验目的 ●掌握细胞总蛋白提取技术 ● 掌握SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳技术 ● 掌握蛋白质转印及抗体染色技术 ● 掌握ECL试剂的使用、X-片曝光及显影方法

  3. 实验原理 ●将获得的蛋白质样品通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 [SDS-olyacrylamide gelelectrophoresis], 对不同分子量的蛋白质进行分离 ● 将分离到的蛋白质通过转移电泳方式转印至固 相支持物上(PVDF膜 硝酸纤维素膜或尼龙膜上) ●用抗靶蛋白的非标记抗体（一抗）与转印膜 进行反应，使其与膜上的靶蛋白发生特异性结 合.

  4. ●结合上的抗体与辣根过氧化物酶标记的二抗 进行结合; ● 经ECL发光试剂作用、X-光片曝光、显影既可显示与特异抗体结合的靶蛋白条带。

  5. ECL 试剂 + + 一抗 一抗 二抗 (辣根酶标记的羊抗兔IgG) 一抗(兔抗Actin) 曝光后的蛋白条带 X光片曝光显影 含有转印蛋白的PVDF膜 ECL 转印膜上蛋白检测示意图

  6. ◆ 实验分为三个部分 ●细胞总蛋白质的提取及含量测定； ●SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 ●凝胶转膜及其检测

  7. ♣实验流程 提取细胞总蛋白、测定含量 ↓ 制备SDS-PAGE胶 ↓ 蛋白样品变性、电泳 ↓ 凝胶转膜 ↓ 封闭(室温1小时) ↓ 一抗反应(4℃过夜) ↓ 二抗反应 (室温、避光50分钟) ↓ ECL试剂作用 ↓ X-光片曝光、显影 ↓ 结果分析

  8. ♣实验方法

  9. 第一部分 细胞总蛋白的提取及含量测定

  10. ◆细胞总蛋白裂解液　 1 X PBS 80ml Tritonx-100 1ml 　　 去氧胆酸钠 0.5g SDS 0.1g 　　 补1x PBS缓冲液至　　　 100ml PMSF储存液(100mmol/L) ★ PMSF储存液为17.4mg/ml异丙醇 -20℃保存.

  11. ☻提取细胞总蛋白 选取于60mm细胞培养皿中培养的 Hela 细胞(细胞数约为5 X 106/培养皿） ↓ 吸弃细胞培养液，用4℃预冷的1X PBS 洗细胞表面3～4次（－80℃冻存,至少可保存两周) ↓ （ 由－80℃取出冻存细胞）每培养皿加入100ul 蛋白裂解液，轻轻晃动，使裂解液均匀铺于细胞表面 ↓ 冰浴 40分钟，期间晃动3 ~4次 ↓ 用细胞刮子集中裂解液，收入1.5ml EP 管中， 12,000g 4℃ 离心20min ↓ 　小心吸取上清液并分装 ，-80℃保存

  12. ★提取细胞总蛋白注意事项 ●FMSF严重损害呼吸道黏膜、眼睛及皮肤，吸 　　　入、进或通过皮肤吸收有致命危险。一旦眼睛 　　　或皮肤接触了PMSF，立即用大量水冲洗. ● PMSF(苯甲基磺酰氟)在水溶液中不稳定, 应在 　　　临用前加入，使终浓度为1 mmol/L ( 10ul储 　　　存液/ml裂解液 )

  13. 　● 　为防止蛋白降解， 操作全部应在冰上完成, 　　　　所用离心机需提前预冷. ●　提取的蛋白质样品应小量分装,冻存于-80℃, 　　　　切勿反复冻融已制备好的样品。

  14. ☻蛋白质含量测定 ◆ 测定意义 ●为确保蛋白质通过SDS-PAGE获得最好分离效 　　果,有必要对提取的蛋白质总量做粗略的估计 ●蛋白质总量不足可能妨碍对目的蛋白的鉴定; 蛋 白质含量太高则会使带形扭曲,甚至会影响此电泳 方法的分辨力

  15. ◆ 蛋白质含量测定常用方法 ● 标准Bradford分析法 ●双缩尿测定法 ●紫外光谱吸收法 ●Folin酚法

  16. ☻ 测定细胞总蛋白含量步骤 (Bradford) ◆ 制作样品蛋白标准曲线 　将牛血清白蛋白(BSA）用生理盐水配制成 0.5mg/ml的标准品蛋白，４℃保存 　　　　　　　　　　　　　↓ 　　　　 　用PBS稀释上述标准品蛋白，使成　　 0、2、4、6、8 、10ug/100ul 　分别编号为1、2、3、4、 5、6 　 　　　↓ 　 每管中分别加入1.5ml考马斯亮蓝使用液 　　↓ 　紫外分光光度计上测定595nm吸光度值 　　↓ 　依据所得读数制作标准曲线图

  17. ◆测定样品蛋白浓度 　　　　吸取适量样品蛋白加至PBS中　 　　　　　　使总体积至100ul 　 　　　　　↓ 　　　向上述管中加入1.5ml考马斯亮蓝使用液 　　　　　　　↓ 　　　　　　测定595nm吸光度值　 　　　　　　　↓ 　　　　将所得读数与标准曲线图比对， 　　　　　从而推算出蛋白样品浓度

  18. ◆　标准曲线及待测蛋白样品稀释方法 编号　　加样量　　　生理水量　　考马斯亮蓝　　　　实际浓度　 （ＢＳＡ） 1 　　　０ul100ul1500 ul　　　　 ０ug/100ul 2 4ul96ul1500 ul 2 ug/100ul 3 8ul92ul1500 ul4 ug/100ul 4 12ul88ul1500 ul6 ug/100ul 5 16ul84ul1500 ul8 ug/100ul 6 20ul80ul1500 ul10ug/100ul 蛋白样品 12 ul98 ul1500 ulug/100ul 2 2 ul98 ul1500 ulug/100ul 32 ul98 ul1500 ulug/100ul 42 ul98 ul1500 ulug/100ul

  19. BSA 浓度　OD 值2ug0.08 4ug 0.169 6ug 0.265 8ug 0.327 10ug 0.377

  20. ★测定蛋白含量注意事项 ●制作的BSA标准曲线如不规律，应重新再做 ● 如果待测样品浓度过高（如组织提取物)，可用生理盐水 将其稀释10～20倍后测定；如样品浓度低，可适当增加 样品微升数或减少水的微升数. ●比色皿的清洁：考马斯亮蓝不易被清水冲洗干净，因此使用后 的比色皿除用清水冲洗后，还需用无水乙醇将比色皿浸泡数分 以脱色，而后分别用自来水、蒸馏水冲洗后备用。

  21. 第二部分 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳

  22. ◆ 原理 ●　SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳是对蛋白质做定性 　　　分析的常用的实验方法, 适用于蛋白质纯度检 　　　测和分子量测定　 ● SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分为只有分离胶的 　　　连续系统和既有分离胶又有浓缩胶的不连续系统. ● 连续系统的电泳体系中缓冲液pH值及凝胶浓度 　　　相同,带电颗粒在电场作用下，主要靠电荷和分子 　　　筛效应。

  23. ● 在不连续系统中由于缓冲液离子成分、pH 、凝 　　胶浓度及电位梯度的不连续性，带电颗粒在电场 　　中泳动不仅有电荷效应， 分子筛效应，还具有把 　　样品中的复合物全部浓缩于极小体积的能力. 当样 　　品首先通过高度多孔性的积层胶时，样品中所含 SDS多肽复合物在分离胶表面聚集成一条很薄的 　　区带（或称积层），因此其分离条带的清晰度及 　　分辨率均较高。

  24. ● SDS聚丙烯酰胺凝胶的有效分离范围 　　取决于灌胶的聚丙烯酰胺的浓度和交联 度. 在进行电泳时,蛋白质分子的迁移速 度取决于分子大小 .

  25. ＳＤＳ聚丙烯酰胺凝胶的有效分离范围 丙烯酰胺浓度(%)　　　　　　线性分离范围／KDa 1510-43 12 12-60 10 20-80 7.5 36-94 5.0 57-212

  26. ●对蛋白质样品做SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳 　　分析时，要在样品中加入含有SDS（十二烷 　　基磺酸钠）、-巯基乙醇、指示剂及甘油或 　　蔗糖的电泳上样液． ●SDS是一种阴离子表面活性剂，它可以断开 　　分子内和分子间的氢键，破坏蛋白质分子的 　　二级和三级结构；-巯基乙醇是强还原剂， 　　它可以断开半胱氨酸残基之间的二硫键．

  27. ●　蔗糖或甘油可以增大上样溶液的密度，有助于●　蔗糖或甘油可以增大上样溶液的密度，有助于 　　加样时样品溶液沉入加样孔底部; ● 样品蛋白中加入电泳上样液后，要经过高温处 　　 理，使SDS与蛋白质充分结合，造成蛋白质完 全变性和解聚，并形成棒状结构; ●电泳上样液中通常含有溴酚蓝染料做指示剂， 　　 用于控制电泳过程;

  28. ☻制备SDS-PAGE凝胶程序 ●制备电泳用玻璃凝胶槽　 ● 确定灌制分离胶液面标志线

  29. ◆ 配制分离胶和浓缩胶 配制10%SDS-PAGE分离胶 (15ml) 5%浓缩胶(4ml) 　去离子水 5.9ml 2.7 ml 30%丙烯酰胺 5.0ml 0.67ml 1.5mol/L Tris-Cl pH8.8 3.8ml / 1.0mol/L Tris-Cl pH6.8 / 0.5ml 1 0%过硫酸胺 0.15ml 0.04ml 10%SDS 0.15ml 0.04ml ＴＥＭＥＤ（临用前加入）0.008 ml 0.004ml ●取上述分离胶1ml, 加入TEMED3ul, 混匀后用其 封电泳用玻璃夹板周边至其凝固．

  30. ◆灌制分离胶 ●在分离胶液中加入 6ul TEMED，混合均匀，迅速 用巴斯德吸管轻轻加入玻璃凝胶槽中，直至液面标 志线处．　 ● 立即用 0.1%SDS液覆盖胶面，室温放置约40分钟 至分离胶凝固。

  31. ●轻轻倒掉0.1%SDS覆盖液，去离子水冲洗分离胶●轻轻倒掉0.1%SDS覆盖液，去离子水冲洗分离胶 表面2-3次，洗净未聚合的丙烯酰胺凝胶，用吸水 纸吸掉残留的液体。 ●将凝胶板垂直放置，轻轻加入5%积层胶液，插入 样品梳，室温凝胶约40分钟。

  32. ◆ 蛋白样品变性 ● 由-80℃冰箱取出细胞总蛋白样品，立即插入冰中 （ 减少蛋白降解）待其融化 ● 吸取15ul 细胞总蛋白样品 , 加入 4×蛋白质凝胶电泳 上样液 , 将二者轻轻混合, 98℃变性8分钟, 立即插入 冰中 ● vortex数秒，短暂离心后轻轻加入凝胶孔中

  33. ◆电 泳 ●正确连接电泳连线（负极在上，正极在下）以保证电荷 由负极向正极方向流动。 ●接通电源,将电压调至100V,使样品通过浓缩胶（电压约 8v/cm）; 当染料进入分离胶后，将电压调高到130V （约15v/cm )继续电泳,染料至分离胶适当位置时结束电 泳 　 ●尽量在4℃冰箱中进行电泳　

  34. ★ 制备凝胶及电泳中注意问题 ●丙烯酰胺和双丙烯酰胺在聚合前具有很强的神经 毒性并容易吸附于皮肤，其作用具有累积性, 故 称量时应戴手套及口罩 ● 不同厂家的SDS可引起多肽的迁移图谱变化较大， 建议找出个人喜欢的某一试剂级别并认准使用 ● 电泳同时设立标准蛋白分子量Marker

  35. ● 过硫酸铵会缓慢分解，应隔周新鲜配制; ● 一旦加入TEMED，应立即混旋并快速灌注入玻璃夹 槽中; ● 为保持电泳的平衡，在无样品孔中也应加入适量的4x 蛋白质电泳上样缓冲液;

  36. ● 制备凝胶电泳用玻璃板的硅化处理 将二氯二甲硅烷用氯仿或庚烷配成5%溶液，用其 浸泡或擦拭玻璃板, 有机溶剂挥发时，二氯二甲硅烷 即沉积在玻璃制品上。使用前用水反复冲洗多次或于 180℃烘考2小时。

  37. 第三部分 凝胶转膜及其检测 通过电转移法将ＳＤＳ－PAGE胶上分离到的蛋白质转印至PVDF膜上

  38. ◆转膜步骤 ●PVDF膜预处理：剪裁与胶大小一致的PVDF膜， 　　将其浸入甲醇液中浸泡10sec 、去离子水中浸泡 5min、 1 X转移缓液中浸泡至少15min。 ● 剪裁与胶同样大小的6层滤纸，用转移缓冲液打湿 　　后待用。

  39. ●电泳结束后由电泳槽上取下电泳板，将其平置●电泳结束后由电泳槽上取下电泳板，将其平置 （ “凹”面玻璃板在下）,小心取出两玻璃板之 间的垫片，掀去上层玻璃板，切除多余凝胶， 将样品胶在转膜液中漂洗一次。

  40. ●安装转膜板： 打开转膜夹板,由阳极侧开始, 依次为海绵垫片→3层 滤纸→PVDF膜→样品凝胶→三层滤纸（排除气泡） →海绵垫片

  41. 胶

  42. ●　扣紧转膜夹板，放入含有转膜缓冲液的转移●　扣紧转膜夹板，放入含有转膜缓冲液的转移 　　电泳槽中。 ● 接通电源，恒压状态下，80v 转膜2h（此步 操作宜在 4℃冰箱中进行）。

  43. ★注 意 ●为避免操作中的失误, 在转移前将膜与胶做同侧 标记； ● 检查样品凝胶是否与转移槽的 “-”侧保持一致 , 以 确保样品蛋白由凝胶转移至PVDF膜 .

  44. ◆封闭转印膜 ●转移结束后, 小心取出转移膜（用铅笔轻轻瞄出蛋白 Marker带），在1XTBST液中漂洗两次 ●将转移后的膜放入5%(w/v)脱脂奶粉中，室温、摇床 上避光封闭1h（ 或4℃过夜）

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