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第 7 章 蛋白质翻译 ( Protein Translation )

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第 7 章 蛋白质翻译 ( Protein Translation ). 概述 . 第一节 基本元件 . 第二节 遗传密码( Genetic code ) . 第三节 肽链的合成 . 第四节 准确翻译的机制 . 第五节 蛋白质前体的加工与转运机制. 概述. ★ 蛋白质翻译是基因表达的第二步. ★ tRNA 在翻译过程中起“译员”的作用. ★ 参与翻译的 RNA 除 tRNA 外,还有 rRNA 和 mRNA.

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第7章 蛋白质翻译

(Protein Translation)

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概述

第一节 基本元件

第二节 遗传密码(Genetic code)

第三节 肽链的合成

第四节 准确翻译的机制

第五节 蛋白质前体的加工与转运机制

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概述

★蛋白质翻译是基因表达的第二步

★ tRNA 在翻译过程中起“译员”的作用

★ 参与翻译的RNA 除 tRNA外,还有rRNA 和 mRNA

★ tRNA 既是密码子的受体,也是氨基酸的受体

★ tRNA 接受AA要通过氨酰 tRNA 合成酶及其自身的

paracodon 的作用才能实 现

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★ tRNA 通过其自身的 anticodon而识别 codon

★ 密码子有自身的特性

三联体 前两个重要 通用性 摇摆性

有一定的使用效率

★ 多种翻译因子组成翻译起始复合物,完成翻译的起始、

延伸和终止,并且保证其准确性

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一、 tRNA

最小的 RNA,4S,70 ~ 80个base

1、 tRNA的高级结构

1964 Holly. R. 鉴定出 tRNAphe 的二级结构为三叶草

形(77个NT)

(1) 三叶草结构 (5个臂 4个环)

a、氨基酸接受臂(aa accept arm)

• tRNA 的5’与3’-末端碱基配对形成

• 3’ 端永远为不配对的CCA序列

• 最后的A的 3’ 或 2’-OH可以被氨酰化

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b、另外是 D (DHU环 双氢脲嘧啶)环 D臂

反密码子环 反密码子臂(anti—codon arm)

附加臂(extra arm)TψC环 TψC臂

其中 附加臂通常是可变的

c、 含丰富的稀有碱基(约70余种 碱基 核糖残基)

反密码子 3 ’ 端邻近部位………..

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aa接受臂

TψC环

DHU环

附加环

反密码子环

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---aa accept arm 位于“L”的一端,契合于核糖体的肽基

转移酶结合位点 P A, 以利肽键的形成

(2) “ L”形三级结构

a、 “L”构型的结构力

• 二级结构中的碱基堆积力和氢键

• 二级结构中未配对碱基形成的氢键

b、 “L”结构域的功能

---anti-codon arm 位于”L”另一端,与结合在核糖体

小亚基上的 codon of mRNA配对

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---“L”结构中碱基堆积力大

使其拓扑结构趋于稳定

wobble base

位于“L”结构末端

堆积力小

自由度大

使碱基配对摇摆

--- TΨC loop & DHU loop

位于“L”两臂的交界处,

利于“L”结构的稳定

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2、 tRNA 的种类

(1) 起始tRNA和延伸tRNA

起始tRNA:

Prok中, 携带甲酰甲硫氨酸(fMet)

Euk中, 携带甲硫氨酸(Met)

延伸tRNA: 其他tRNA…..

(2) 同工tRNA(isoaccepting tRNAs)

携带AA相同而反密码子不同的一组tRNA

• 不同的反密码子识别AA的同义密码

• 结构上能被AA– tRNA合成酶识别的共性

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Ni

[14C]-Cys-tRNACys

[14C]-Ala-tRNACys

3、 副密码子与氨酰基tRNA的合成

(1) 氨酰基tRNA的合成执行着双重功能

• 为肽建的合成提供能量

• 执行遗传信息的解读

实验证实—模板mRNA只能识别特异的tRNA而不是AA

(2) AA– tRNA合成酶(AARS)

★ 需要三种底物 AA tRNA ATP

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AARS

★ 因此有三个位点

aa binding site

tRNA binding site

ATP site

★反应为

AA + tRNA + ATP

AA– tRNA + AMP + ppi

氨酰基与tRNA的 3’端A的 2’/3’—OH结合

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氨酰-tRNA合成酶结合错误氨基酸的校正

氨酰-

tRNA合

成酶结

合tRNA

的校正

化学校正

动力学校正

增加了负载前水解掉的机会

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★ Prok中AARS有20种,对AA专一(同工受体)

★ Prok和Euk有一定的差别

★ 可分为两类

反应机制的差别:

Type Ⅰ类酶 先将氨酰基转移到tRNA 3’ 端A的 2’-OH

然后通过转酯反应转移到 3’ –OH上

TypeⅡ类酶 直接将氨酰基转移至 3’ –OH 上

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两类酶与tRNA反应时--接近模式不同

合成酶与tRNA相互束缚的普通模型提出:

蛋白沿L型分子的一侧束缚tRNA(tRNA的两端被束缚)

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tRNA binding siteaa binding site

Paracodon of tRNA 装载Amino Acid(R)

(3)Paracodon (副密码子)的概念;

tRNA中决定负载特定氨基酸的空间密码

tRNA中的特定序列与AARS 的tRNA binding site的特异基团间的分子契合

AARS

slide22

a、 1988. Schimmel 和侯雅明

G3 : U70是决定tRNA 负

载 Ala的特异密码信息

b、 1991. schumman L.

证明;tRNAmetf 的paracodon 位于anti-codon

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tRNA Ala(GGC)

具有G3 :U70paracodon

tRNAAla(UGC)

c、 paracodon 的特征

--- 为同一种AARS 所识别的一组同功受体具有相同的

副密码子

--- paracodon 是为AARS(特定氨基酸)所识别的若干

碱基(并非均为一对核苷酸)

--- AARS 对paracodon 的识别与结合是通过氨基酸与

碱基之间的连接实现的。属于生物 II 型空间密码

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包括

Val,Arg,Gln,Glu,Ile,Leu,Met,Trp,Tyr

paracodon 大多位于反密码子臂

d、按氨基酸序列将AARS分为两类

type I

type II

paracodon 大多位于氨基酸接受臂

个别还同时在附加臂上有相应碱基

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二、 mRNA

单顺反子mRNA(monocistronic mRNA):

只编码一个蛋白质的…..

部分Prok 所有Euk的mRNA

多顺反子mRNA(polycistronic mRNA ):

mRNA 分子的组成:

• 编码区 起始AUG到终止密码子

• 前导序列AUG之前的 5’ 端非编码区(5’UTR)

• 尾巴 终止密码子之后,不翻译的 3’ 端

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1、 原核生物mRNA的特征

(1) 大部分为多顺反子

spacer: 各顺反子之间(基因之间)的非编码区

长度变化很大

因此,多顺反子的mRNA翻译有两种情况:

a、spacer较长时,下一个基因的产物合成起始是独立的

b、spacer长度较短时,两个顺反子使用相同的核糖体或小

亚基( 相当…………,有S-D 序列的特征)

所以-----Prok中多顺反子mRNA中各基因的产物数量不一

定相等

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Spacer 较长时

Spacer 较短时

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上节课内容回顾:

1、tRNA

三级结构、种类

2、氨酰tRNA合成酶(AARS)

氨酰tRNA合成执行双重功能

AARS反应位点、校正活性、种类

3、副密码子

特征

4、mRNA

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(2) 其他特征

a、 5’ 端有300个左右NT的leader(A/G----AUG)

b、 AUG作为起始密码子(GUG、UUG)

c、 AUG前有 S – D 序列

S – D序列(Shine-Dalgarno sequence): 位于

AUG上游 4 ~13 个NT处的富含嘌呤的 3 ~9

个NT的共同序列,其一致序列为 AGGAGG

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• 可受核糖体结合并保护

• 与核糖体小亚基内16S rRNA 的 3’端富含嘧啶的序列

3’------UCCUCC-----5’互补,使 tRNA正确定位于起始

codon

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2、 真核生物mRNA的特征

(1) 一般为单顺反子

(2) 5’ 端的帽子对翻译有增强作用,且 5’ 帽子和

3’polyA尾对翻译效率的调节有协同作用

(3) “第一AUG规律” 即----- 绝大部分以AUG作为起

始codon

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+4

+1

-3

(4) 起始AUG有如下特点

a、 其合适“上下文”为 (Kozak等人)

C C A C C AUG G

只有 5 ~10%的情况下………

b、 -3位的A和+4位的G…..至关准确翻译

(5) 双功能mRNA

许多病毒都具有 如SV40的衣壳蛋白VP2和VP3

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三、核糖体及rRNA的结构

● 是翻译进行的场所 ,含大小亚基

● Prok. protein 约占细胞的10%,RNA占总RNA的

80%,Euk中相对比例小些

● 细菌中常以多聚核糖体的形式

Euk中大多与细胞骨架和内质网膜结合在一起

(游离、多聚)

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1、 核糖体的结构

(1) Prok E.coli

小亚基 16SRNA 21种proteins S1-------S21

大亚基 23SRNA 5SRNA 34种proteins L1---- L34

Euk

大亚基 28SRNA 5SRNA 5.8SRNA 49种proteins

小亚基 18SRNA 33种proteins

(2) 核糖体的装配

核糖体蛋白质+rRNA-----

按一定的顺序形成完整的核糖体

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3、核糖体的活性位点

30S小亚基 头部 基底部 中间有一豁口

50S大亚基 三个突起

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• 两者之间形成一个mRNA通道

(Prok.与 Euk.之间互有异同)

• 根据功能将核糖体上的活性部位分为两类

♪ 翻译区域 7个活性位点 占2/3

♪ 逐出位点 2个位点(多肽的逐出) 占1/3

(1) mRNA结合位点

a、位于30S 亚基的头部

b、S1 (可防止mRNA 链内碱基对的形成)

(与S18和S21--mRNA、起始tRNA IF3)

slide43

c、 16S rRNA 3’端是mRNA 与小亚基初始结合不可

缺少的

(2) P位点: 肽酰-tRNA位点

a、 大部分在小亚基内 ,小部分在大亚基内

16SrRNA的3‘末端、L2等蛋白

b、 能够与起始 tRNA (fMet--tRNAf)相结合,且P

位点会影响A位点的活性

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(3) A位点: 氨酰基 tRNA 位点

a、 主要在大亚基上

b、 A位点内mRNA 表面只对特定的 aa—tRNA 分子

表现出特异性,且A位点结合aa—tRNA 要求在P

位点上必须有肽酰tRNA存在

(4) 肽基转移酶活性位点

活性中心在大亚基上,位于P位点和A位点的连接处

靠近 tRNA的接受臂

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(5) 5s rRNA位点(与tRNA进入有关)

(6) EF—Tu位点

位于大亚基内,与氨酰基 tRNA的结合有关

(7) EF—G 转位因子结合位点

大亚基靠近小亚基的界面处

(8) E 位点(包括两个:脱酰基tRNA和多肽的逐出位点)

• E1为脱酰基tRNA 离开核糖体提供出口

• E1对蛋白质合成的准确性起重要作用

• E2为多肽离开核糖体提供出口(占核糖体1/3)

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E2 位点

fMet--tRNAmetf (Met--tRNAmeti) way in P site

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第二节

遗传密码

(Genetic code)

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一、 通用的三联体密码

DNA遗传信息

遗传密码

蛋白质

mRNA

1、 Codon 的特征

a、概念: mRNA上连续排列的三个NT序列,编码一个

AA信息的遗传单位

b、 具有四大生物系统(病毒、细菌、动植物)的通用

性和保守性(Mt除外)

C、 一个基因序列中,有不重叠性和无标点性

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2、 密码子破译

实验基础:

Ⅰ 蛋白质体外合成的实验基础

♪ E. coli 的无细胞体系(DNA、mRNA、tRNA、

核糖体、AA—tRNA合成酶)

♪ 破坏掉DNA、耗尽mRNA后

♪ 加入模板(外源mRNA或人工合成的多聚NT)

加入ATP、GTP、AA等成分合成新的肽链

推知编码某些AA的密码(比较………)

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Ⅱ 1955 Grunberg-Mango 和 Ochoa 从细菌中分离出

的多核苷酸磷酸化酶

♪ 催化合成RNA而不需要模板DNA或RNA

♪ 合成各异的多聚核苷酸 poly(A)、poly(AU)………

(依据所加核苷二磷酸的比例不同)

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(1) 以均聚物为模板指导多肽的合成

1961 Nirenberg 和 Matthaei

poly U-----UUU-------编码 Phe

poly C ------Pro poly A --------Lys

(2) 用 tRNA 结合法破译 codon

1964 Nirenberg 和 Leder

• 没有蛋白质合成所需的全部因子存在时,特异

AA—tRNA也能与核糖体---mRNA复合物结合

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• 于是作如下实验

♪ 人工合成多种三核苷酸(UUU、UCU、UGU等)

为模板

♪ 与含核糖体、20种 AA—tRNA和适当离子强度的反应

液保温

♪ 使反应液通过硝酸纤维素滤膜,其中只有核糖体或结

合AA—tRNA的核糖体能留在滤膜上

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实验为20组:

SerC14、Leu、Lys、Arg………….(20种)

Ser 、LeuC14、Lys、Arg………….

Ser 、Leu、LysC14、Arg………….

……………………

分析留在滤膜上的核糖体中的AA—tRNA和其

相应的模板

• 此方法未能破译全部的codon(结合效率)

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Ser-C14….

Leu-C14….

Lys-C14….

Gly-C14….

slide57

(3) Khorana、Nirenberg和Ochoa等又进一步确定和验证

了全部密码子

1968 Nirenberg 和 Khorana 因破以遗传密码的贡献而

获 Nobel 奖(1966)

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二、 密码子的简并现象(Degeneracy of codon)

1、简并现象的概念:

一种AA受两个以上codon 编码的遗传现象

同义codon :

密码子家族(codon family):编码一个AA的4个

密码子中 ,仅第三个NT不同

★ codon 的简并可把突变对生物体的影响降到最小

2、简并现象的机理

(1) 同工tRNA(isoaccepting tRNAs)

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(2) 摇摆假说(Wobble hypothesis)

1961 Crick 提出 又称 “变偶假说”

内容: codon 的前两位碱基和反密码子配对时遵循

Watson—Crick 原则,而第三位碱基有一定的灵活性

即 codon 的3rd-Nt与 anti-codon 的1st-Nt(Nt34)

mRNA 5’…CGU...CGC...CGA…CGG…AGA…AGG…3’

摆动 tRNA

GCG

3’→5’

GCU

5’

UCU

5’

slide60

(3)摇摆碱基的摇摆配对原则

摇摆碱基--- anti-codon 的1st-Nt

摇摆配对原则

I-------次黄嘌呤

anti-codon 的

1st-Nt

codon 的 3rd-Nt

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(4) 摇摆碱基摇摆配对的机理

a、 由tRNA 反密码子环的

空间结构所决定

♪ 摇摆位点 34th-Nt 处

于堆积碱基的末端,

所受堆积力较小,有

较大的自由度来进行

选择配对

b、 anti-codon 的1st-Nt( 摇摆位点)被修饰的频率很高,

导致配对范围增大

slide64

三、 tRNA丰度和密码子的使用频率

生物GC%不等→ → 各种codon出现的频率不等

因此

♪ 识别同一AA的不同tRNA---同工tRNA量不等

♪ 不同生物间同一同工tRNA 的量不等

☻ tRNA 的丰度和 codon 的使用频率是进化过程中形

成的基因表达调控机制之一

slide65

1、 tRNA 丰度与 codon 的使用频率正相关

a、 需要量多的蛋白质,有关密码子的使用频率高,

相应的 tRNA 量多

如:核糖体蛋白质 Rec A蛋白质

b、 需要量少的蛋白质,有关codon 的使用频率低,

相应的 tRNA 的量少

2、 codon 的使用频率与 codon 与 anti-codon 间的作用

强度有关

即-----同义 codon中,其使用频率有一定差异(明显)

slide66

原因:

a 、 适中的作用强度有利于翻译的进行

b、 弱配对作用形成的 aa—tRNAaa需要较长的时间进

入A位点

c、 强配对作用形成的 aa—tRNAaa需要较长的时间从

核糖体的P位点卸载

因此,进化过程中自然选择 codon/anti-codon 间结合

强度适度的codon以保证最佳的 protein 合成速率

slide69

四、线粒体密码的特殊性

1、 线粒体中具有与通用密码不同的编码信息

(1) 具体不同

(2) 线粒体的codon表排列的比较整齐

均为2、4、6

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起始

Ile

Arg

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(3) 线粒体中“三中读二”方式可减少 tRNA

线粒体中只有22种tRNA

(摇摆假说 使用通用密码子至少得32种 tRNA)

a、 识别一个密码子家族的tRNA的anti-codon的摇摆碱基

均为U U-------U、A、C、G

b、 两个一组的密码子,其相应 tRNA的 anti-codon 的摇

摆碱基配对情况分别为: G → C/U (Py)

U*(经过修饰) → G/A(Pu)

slide73

蛋白质合成速度很快

Prok. 15AAs/S ( 37◦C )

Euk. 低些 (血红蛋白…….. 2AA/S)

合成方向…….. N 端 → C 端

一、合成的起始

★ 指A的第一次进位以前

★ 核糖体结合于mRNA→ → →起始复合物的形成

( 包括第一个 aa-tRNA)

相对缓慢

slide74

★ 核糖体亚基…..游离存在的和终

止后核糖体解离的亚基

slide75

1、 起始 tRNA 与起始密码子的识别

(1) 细菌

• tRNAMetf能识别 AUG、GUG

• tRNAMetf +Met………. fMet---tRNAf

转甲酰酶

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tRNAMetm识别内部的AUG,内部GUG由tRNAVal识别

(2) Euk 中 tRNAMetitRNAMetm

(3) 线粒体中 Met甲酰化

(4) tRNAMetf 和tRNAMetm结构上存在差异

• tRNAMetf接受臂的两个碱基均为不配对状态

• tRNAMetf .....TψCA,而tRNAMetm …..TψCG

• 反密码子的3’端临位

tRNAMetf …A tRNAMetm…烷基化的A

slide77

起始 tRNA 的结构

G-C

G

烷基化的A

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2、 起始复合物的生成

起始复合物: 核糖体、mRNA、aa-- tRNA三元复合物

(1) 起始因子及 30S 亚基与mRNA的结合

♦ Prok.的三种起始因子(initiation factor IF)

参与蛋白质合成起始的可溶性蛋白因子--辅助

三种IF分别为: IF1 IF2 IF3

IF1---------加强IF2、IF3的酶活

slide79

IF2--------- 促使 fMet---tRNAMETf选择性的结合在

30S亚基上

IF3--------- 促使 30S亚基结合于 mRNA 起始部位,阻

止30S亚基与50S亚基的结合,或者说促进

70S核糖体的解离

a、 30S亚基与 mRNA 的结合

IF3 + 30S

30S---IF3

+ mRNA

30S + IF3 + mRNA(30S复合物)

slide81

☆ IF3--赋予30S 亚基与mRNA 结合的能力

(30S亚基没有与mRNA主动结合的能力)

☆ 30S 亚基与mRNA 的结合

SD与16S rRNA的 3’ 端………

☆ SD序列控制起始复合物形成的频率……翻译产物数量

☆ IF3 使30S 亚基不能与50S亚基结合(形状…..)

☆ 30S 复合物中,起始 codon 正好位于P位点,且只有

fMet—tRNAMetf才能进入

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(2) 起始 tRNA 的结合

IF2 + fMet---tRNAf

IF2---fMet---tRNAf

GTP

+ 30S---IF3---mRNA

30S---IF3---mRNA---IF2---fMet---tRNAf---GTP

◆ IF2与起始 tRNA 之间作用严格专一

很强的GTP酶活性

slide83

(3) 70S 起始复合物的形成

a、 IF3游离

30S---IF3---mRNA---IF2---fMet---tRNAf---GTP

与50S亚基的结合导致(IF3与50S亚基的竞争)

b、 70S 起始复合物形成

50S亚基的结合激活IF2 的GTP酶活性,水解

GTP并解离下来(IF1)

GTP水解释放的能量改变两者的构象

形成 30S---mRNA---fMet---tRNA---50S

IF---辅助因子

slide85

c、 Met的甲酰基的除去…..合成到15~30个AA

◎ 去甲酰基酶(细菌、线粒体)

◎ 氨肽酶去除Met

3、 Euk 蛋白质合成的起始

(1) 机制与Prok.基本相同,差异主要是所涉及的因素

本身的差异所导致

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a、 核糖体较大

b、 mRNA 是单顺反子

c、 其mRNA 具有m7GpppNp帽子结构,从而导致起始时

识别信号的差异

d、 Met---tRNAMet不甲酰化

e、 有较多的起始因子

(2) Euk蛋白质合成的起始因子

slide88

(3) 起始机制

对AUG的识别涉及:

* 密码子与反密码子的配对

* 起始AUG上下文结构特点的作用

Euk 蛋白质合成起始中的重要参与者:

Met—tRNAi 核糖体 AUG上下文特点

eIF –2作用 eIF-4F

slide90

eIF-2

Met

Met

Met

slide92

二、 肽链的延伸

Prok肽链的延伸以氨酰-tRNA 进入70S 起始复合物

的A位为标志(第一个进位过程)

1、 进位

(1) 三元复合物生成

EF—Tu + GTP

EF—Tu--GTP

三元复合物

+ 氨酰基--tRNA

起始 tRNA 不能结合,保证了……..

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(2) 三元复合物进入A位

§ 要求P位点被起始 氨酰tRNA 或肽酰-tRNA占据

§ 同时,EF-Tu催化GTP水解,释放 EF—Tu—GDP

(3) Ts循环 (Tu—Ts 循环)

EF—Ts 能够使 EF—Tu—GDP转变为 EF—Tu—GTP

因为----- EF—Tu—GDP 不能有效地结合氨酰基—tRNA

循环过程:

EF—Tu—GDP

EF--Ts

EF—Tu—EF--Ts

GTP 取代

EF—Tu--GTP

slide95

2、 肽键生成(转肽反应)

(1) 肽酰转移酶 (peptidyl transferase)

☆ 位于核糖体大亚基,催化肽键生成

☆ 若干蛋白质、 23S rRNA 、5S rRNA

(2) 形成过程:

把两个氨酰-tRNA 定位于调准的位置

将处于P位的甲酰甲硫氨酰基或肽酰基转移到A位的氨酰基-tRNA 的氨基上形成肽键

肽链延伸一个AA

slide98

3、 移位(translocation)

⊙ 肽键生成后,核糖体沿mRNA向前移动一个密码子的距离

(1) 需要GTP 和 延伸因子 EF—G

a、 过程:

EF—G 和 GTP 结合

------- 核糖体中具有GTP酶活性

的蛋白GTP水解

-------- A位生成的肽基转移到P位,P 位空载的 tRNA

进入E位(此过程 mRNA 移动了一个密码子)

slide102

b、 EF—G和 GDP 必须释放→→→下一个三元复合物进位

抗生素甾酸酶素(fusidic acid)实验证实

c、 核糖体固有的移位性质可被 EF—G 所催化

slide107

5、 Euk 肽链的延伸

(1) 与 Prok 相似

﹡ eEF—1 取代 EF—Tu 和 EF—Ts

﹡ eEF—2 取代 EF—G

﹡ 真菌------ eEF—3 参与(维持翻译的准确性)

(2) eEF—1 大多数由 α、β、γ、δ 四个亚基

eEF--1α----与GTP结合

﹡ 酵母中过量表达可导致翻译忠实性的提高、果蝇

中可延长其寿命

slide108

﹡ 衰老过程中,eEF—1 α活性下降

因此------- 衰老过程中可能伴随着翻译忠实性的下降

﹡ 大量表达还可以提高细胞的生长能力

一些影响细胞生长的因素也可以引起细胞内eEF—1 α的

大量表达, 如:癌基因v—fos 的诱导

(3) 有些资料表明: eEF—2 并不是延伸所必须,只起到加

速的作用

slide109

6、 GTP 的作用

(1) 使各种翻译因子与 tRNA 或核糖体易于以非共价键结合;

水解成 GDP 和 Pi 的反应是释放结合因子的信号

Prok ------ IF2、 EF—Tu 、 EF—G

Euk ------ eIF—2、 eEF—1 、 eEF—2

☆ GTP 是一种变构因子

(2) GTP 水解释放的能量提高核糖体结合氨酰-tRNA 和移

位的能力

(3) GTP 还有使翻译准确的功能

(为去除A位不正确的氨酰-tRNA提供能量)

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1、 所需条件

(1) 终止信号:终止密码子

Prok 和 Euk 都是:UAA、UAG、UGA

(2) 释放因子:

a、RF

Prok中,RF1 ---- 识别 UAA 和 UAG

RF2 ---- 识别 UAA 和 UGA

RF3 ---- 刺激RF1 和 RF2 的活性

slide113

Euk 中 只有eRF ----- 识别三种终止密码子

b、 RRf(ribosome releasing factor)

核糖体释放因子

2、 终止机制

(1) Prok

a、 RF 作用于A 位点(需要 P 位被肽酰-tRNA 所占据)

b、 体外实验证实,RF 与终止密码子之间特异的相互作

用,类似于反密码子和密码子之间的碱基配对的相互

作用

slide114

c、 RF 的某种作用改变肽基转移酶的肽基转移特性

将P位上的肽基转移到水分子上而并不形成新的肽键,导

致肽基 – tRNA的水解

d、 RF3 与 GTP 结合为肽基转移及随后的核糖体释放提供

能量

e、 RRF 使核糖体与 mRNA 和脱酰基-tRNA 与终止因子分

离(GTP、EF--G)

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AARS:AA binding site,tRNA binding site, ATP site

例;CysHS—CH2—CH—COOH

NH2

结构相似

错误识别

错误负载

错误翻译

Ala H—CH2—CH—COOH

Ala-RS

NH2

一、 氨基酸与tRNA间的负载专一性

1、 氨酰tRNA合成酶(AARS)对氨基酸的特异识别与结合

(1)AA binding site 对结构相似的氨基酸的双筛作用

slide120

IleH COOH

CH3—CH2—C—CH

CH3 NH2

200X

Ile-RS

ValH COOH

1X

CH3—C—CH

CH3 NH2

体外Ile & Val 浓度相等的情况下

Val-tRNAIle错误负载机率

1/200!

slide121

体内

Val: Ile = 5:1

Val-tRNAIle错误负载机率

1/40 !!

但实际测定的错译机率仅为1/3000 ?!

slide122

AARS

Mis-loading

How ?

AARS

aa’+ ATP

Mis-activation aa’-AMP+ tRNAaa

aa’-tRNAaa

aa binding site

具有结合位点(B)和水解位点(H)

(双筛位点)

slide123

a、进入aa-binding 时的双筛

Ile/ Val进入B位点

与酶发生诱导契合

Ile分子构型大于Val

H位点柔性部位小

  • Ile进入B位点但不能进入H位点
  • Val进入B 位点并进入H 位点而被降解
slide124

B

B

B

B

H

H

H

H

b、aa-tRNA loading时的双筛

I

I

I

I

aa-tRNA loading

V

V

V

Val—AMP

slide125

(2)无相似结构的氨基酸间

其特异AARS分子无双筛位点

例; aa site of Tyr-RS

只能与Tyr发生诱导契合,

无双筛位点

2、在AARS 的介导下

tRNA 的副密码子(paracodon)对aa 的准确负载

slide126

二、anti-codon对codon 的准确识别

摇摆假说 anti-codon 的碱基修饰

三、对第一个 Met (AUG)的准确起译

1、Prok.

• SD序列(AGGAGG)与16S rRNA 3’端富含嘧啶序

列的准确识别

( SD 与 AUG间隔区-------7±2NT 富含AT)

2、 Euk.

• eIF4F 对5’ 帽子的准确识别及对CCACCAUGG的扫描

slide127

3、IF2(eIF2)和Tu(EF1)酶的专效性

a、 Prok. IF2与fMet—tRNAfMet间有严格的专一性

Euk. eIF2与Met—tRNAiMet间………………..

b、Prok. EF—Tu识别Met—tRNAmMet

Euk. EF1

原因也在于两种tRNA之间存在明显的结构差异

slide128

四、对A 位 aa—tRNAaa的两次校对(成肽前)

ΦEF—Tu 的酶的专效作用的第一次校对

Prok. EF—Tu催化GTP水解后,错配的氨酰tRNA

将从核糖体中剔除

Euk. EF1

Φ密码子和反密码子结合能力的第二次校对

A位上的正确的密码子和反密码子的结合能力比错误

的高3000倍

slide129

第五节 蛋白质前体的

加工与转运机制

slide130

残基的去除、AA侧链的修饰、多肽链折叠成二级、三级甚至四级结构残基的去除、AA侧链的修饰、多肽链折叠成二级、三级甚至四级结构

一、蛋白质前体加工

前胰岛素原的加工

初级产物多肽链

天然蛋白质

slide131

蛋白质的体内折叠

1、 邹承鲁假说:体内蛋白质折叠存在与肽链合成同步进行

(co-translation)

实验证据:肽链合成尚未结束的β-半乳糖苷酶具有

免疫原性和酶的活性

对邹氏模型的有力支持

酶蛋白的N端--天然肽的结构与功能

2、参与蛋白质折叠的两类蛋白质--助折叠蛋白

a、酶: 如蛋白质二硫键异构酶---加速正确二硫键的生成

肽酰脯氨酰顺反异构酶---催化肽-脯氨酰间肽键的旋转反应

slide132

b、分子伴侣(molecular chaperone)

Laskey等人提出 组蛋白+核质素→→核小体

指一类在细胞内帮助新生肽链正确组装成为成熟蛋白

质,而本身却不是最终功能蛋白质分子的组成成分的分

子,称为……

3、分子伴侣的功能和种类

(1)功能

a、同一个分子伴侣可促进多种多肽链的折叠(无专一性)

b、或者阻止多肽的错误折叠

如防止初始翻译的疏水端的错误折叠

slide133

(2)目前研究最多的两个蛋白质家族

◘ 胁迫-70 家族

(stress-70)

◘ 分子伴侣家族

(chaperonin)

Prok.和Euk.

◎ 热休克蛋白Hsp70(heat shock protein , Hsp70)

E.coli DnaK

参与蛋白质折叠、组装、跨膜、分泌与降解

slide134

DnaJ协助DnaK的结合-----有利于新生肽的折叠DnaJ协助DnaK的结合-----有利于新生肽的折叠

GrpE解离复合物而反复循环

slide135

二、蛋白质的转运

机制--

易位与分泌

( secretion)

两种途径(Euk.):

共翻译易位

翻译后易位

slide136

合成蛋白质

蛋白质合成扩散在细胞质内

合成蛋白质

进入顺式高尔基体 部分停留

穿过内膜进入间质(periplasm)

通过外膜

扩散到细胞外

反式高尔基体

选择, 加工,分泌,扩散

蛋白质合成方式

---游离的核糖体

In Euk.

---核糖体附着在粗糙内质网 (rough endoplasmic reticulum RER)

In Prok.

--- 核糖体附着在细胞内膜(inner membrane)

slide137

15—30 aa

1—3 aa

1—10aa 15—20aa

富含Arg+, Lys+ ----- 富含 Phe, Leu, Ile…

S.S.酶切割位点

插入到膜中

亲水螺旋

疏水螺旋

反向平行,形成 hairpin

1、细菌中蛋白质的越膜

信号肽(N端信号序列):分泌蛋白的N端15~30个AA的前

导序列为越膜信号

(signal sequence S.S.)

slide138

作用机制:

signal S. 带正电的区段与带负电的磷脂膜互作,引导蛋白质

进入内膜

疏水区段嵌入磷脂膜内或形成αhelix,

--- 并对磷脂双层膜产生扰动效应,

--- 诱发形成非脂双层结构,

以保证Signal S. 所牵引的蛋白质顺利穿膜

slide140

2、真核生物中蛋白质的越膜(共翻译易位)

信号肽序列(S.S.)和原核类似

(1)越膜机制:

a、S.S.在信号识别颗粒(signal recognition particle

SRP )的帮助下插入到粗面内质网中

slide141

SRP:RNA-蛋白质复合体 7SL RNA和6种蛋白

信号识别结构域(结合GTP)

延伸作用制动结构域

与核糖体结合使肽链的延伸暂时受阻(肽链约70个AA时)

b、结合核糖体的SRP遇到内质网上的受体时不再阻止核

糖体翻译(SSR 信号序列受体)

停泊、坞蛋白 ( docking protein )

c、内质网上的S.S.受体和核糖体受体作用使新生肽进入

易位通道,随之S.S.被切除

☀ SRP的负调控作用 分泌蛋白往往是降解酶类

slide143

(2)越膜后的加工

a、内质网中滞留

b、内质网中加工:

折叠、糖基化等

c、加工后的定位

和分泌

(蛋白中的信号补丁)

slide144

3、真核生物中游离核糖体合成蛋白质的易位

(翻译后易位)

进入不同的细胞器有各

自相应的信号

slide146

思考题

名词解释

单(多)顺反子mRNA S-D序列 副密码子 同工tRNA

同义密码子 密码子的简并性 分子伴侣 信号肽

简答题

1、解释Prok.多顺反子mRNA翻译的两种情况

2、说出核糖体的活性位点及其功能

3、解释同一种tRNA分子所识别的几种同义密码子使用频率差异

的原因。

4、简述Ts循环过程及意义

5、说出Prok.蛋白质翻译过程中的起始因子、延伸因子、终止因

子及各自功能。

6、简述Prok.延伸过程中的主要事件

slide147

7、简要说明Prok.与Euk.的翻译起始过程的差别

8、tRNA三级结构有何与其功能相适应的特点

9、以Prok.为例,说明蛋白质翻译终止的机制

10、简要说明真核生物蛋白质的不同转运机制

11、说明Prok.和Euk.体内蛋白质的越膜机制

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