Todo lo que quisiste saber del ribosoma shunting y que este paper no contestará

1. Todo lo que quisiste saber del ribosoma shunting y que este paper no contestará Balcazar D., Gangemi M., Gómez Acuña L.

2. Traducción en eucariotas

3. INICIO de la TRADUCCIÓN Mediante el reclutamiento cap-dependiente del complejo ternario, seguido de un escaneo lineal de la subunidad 40S. Encuentra el primer codón AUG en el contexto de iniciación apropiado, y la subunidad 60S puede unirse comenzando la traducción. Durante estrés celular, este mecanismo es inhibido, y se activan mecanismos de iniciación alternativos que estimulan la traducción de una variedad de proteínas importantes para responder a este estrés.

4. Algunos factores a tener en cuenta Reconoce el CAP: importante para el escaneo de la subunidad 40S Importante para la formación del complejo ternario, posibilitando cargar el tRNA-Met sobre la subunidad 40S.

5. TRES MECANISMOS ALTERNATIVOS para facilitar o regular el acceso del ribosoma al codón AUG adecuado. 1°) en la región 5’ UTR, la presencia de cortos upstream open reading frames (uORFs), inhiben la traducción del mRNA. Durante la traducción de un uORF, otros complejos ribosomales no pueden unirse al mRNA. Si el uAUG es reconocido eficientemente, o cuando la elongación y/o terminación se da muy lentamente, causa una fuerte inhibición de la traducción del principal ORF.

6. TRES MECANISMOS ALTERNATIVOS… … Pero, en algunos casos, permite una activación relativa cuando el complejo ternario es limitado por la fosforilación de eIF2. mRNAs ATF4 y GCN4: es un mecanismo de reiniciación regulado (saltear uORFs al verdadero codón de inicio).

7. Proteasa del picornavirus (poliovirus) TRES MECANISMOS ALTERNATIVOS… 2°) ribosomas pueden saltearse el cap y ser reclutados al mRNA por un internal ribosome entry site (IRES).

8. TRES MECANISMOS ALTERNATIVOS… 3°)involucra la translocación del ribosoma de una región upstream shunt donor a una downstream shunt acceptor en un mRNA. Se lo conoce como ribosome shunting. Cauliflower mosaic virus (CaMV)

9. En este trabajo se estudió la traducción del mRNA cIAP2. La proteína anti-apoptótica cIAP2: inhibidor directo de caspasas activas (mediadores esenciales de los procesos de apoptosis) y además posee actividad de ligasa ubiquitina E3, mediando la poliubiquitinación y degradación de proteínas apoptóticas como Smac/Diablo y RIP. cIAP2 es un oncogen, y su sobreexpresión ha sido asociada con progresión neoplásica en una variedad de cánceres. Su expresión es altamente regulada tanto a nivel transcripcional y traduccional.

10. ¿Por que empleamos este mRNA cIAP2? Contiene una región 5’ UTR muy larga (2.83-kb), donde hay 64 uAUGs río arriba del verdadero, mostrados en el diagrama lineal. Parece muy improbable que el mecanismo predominante de iniciación de traducción fuese por escaneo mediado por ribosomas. Entonces, examinaron esta región 5’UTR por su potencial capacidad de mediar la síntesis de proteínas mediante un mecanismo alternativo.

11. Objetivos generales • Determinar si la región 5´no codificante del mRNA de cIAP2 media la iniciación de la traducción vía ribosome shunting. • Determinar si el inicio de la traducción de este mensajero es modulada durante estés celular.

12. Estrategia experimental general 5´UTR Fluc ORF 35 nt poly A Distintas construcciones Transcripción in vitro (T4 RNA polimerasa, MpppG) AAAAAAAAAAAAAAAAA Traducción in vitro (Extractos no nucleares de HeLa) Transfección transitoria de células 293T (células embrionarias humanas de riñón) Cantidades equimolares Medición de la actividad de luciferasa

13. Objetivo 1 • Determinar si la traducción de cIAP2 es cap dependiente y si es mediada por una secuencia IRES

14. IN VIVO Transfectados en células 293T. IN VITRO Transcripción in vitro: transcriptos m7G-capped and poly(A)-tailed. Traducción en extractos no nucleados de células HeLa. ¿Afecta el 5’UTR de cIAP2 a la traducción? SI Primero … el 5’UTR del transcripto cIAP2 fue clonado inmediatamente upstream del gen reportero firefly luciferase (FLuc) (p-cIAP2-FL). El 5’UTR de cIAP2 inició la traducción en un 25% con respecto al transcripto con 5’UTR corto y sin estructura (40-nt) en un contexto monocistrónico (p-FL).

15. ¿Hay escaneo cap-dependiente?. Luego … Inserción de una estable estructura RNA hairpin (ΔG: - 60 kcal/mol) para prevenir el escaneo cap-dependiente Reemplazo del m7G cap con un cap ApppG análogo que no puede unir al eIF4E, por lo que no hay escaneo. Fueron traducidas en extractos de células HeLa (C) o transfectadas en células 293T (D).

16. ¿Hay escaneo cap-dependiente?. SI Estructura RNA hairpin inhibió la producción de FLuc by 98% (línea 2). Cap ApppG inhibió la traducción del wild-type 5’UTR tanto en ausencia (lane 3) y presencia (lane 4) de RNA hairpin. HAY TRADUCCIÓN CAP DEPENDIENTE

17. ¿La región 5’ UTR de cIAP2 media la traducción vía IRES? Para testear una actividad potencial IRES de cIAP2 5’UTR. RNA reportero dicistrónico conteniendo el HCV IRES o HCV IRES un invertido. Transfección de RNAs dicistrónicos en células 293T Tratadas con 1μM thapsigargin por 6h para inducir estrés ER, para ver si se activa este mecanismo. No estresadas (condición normal)

18. ¿La región 5’UTR de cIAP2 media la traducción vía IRES? NO 5’UTR media la traducción via cap dependiente y no via IRES No fue detectada traducción mediada por IRES en condiciones normales No fue posible medir actividad de IRES cIAP2 inducida por estrés.

19. ¿Existe una explicación alternativa para es que esta región 5’UTR cIAP2 pueda traducir de una manera cap-dependiente? Existe una conformación termodinámicamente estable, con importantes características estructurales dentro esta región, muy similares a las requeridas para el ribosome shunting de la 35S RNA de CaMV del pararetrovirus. Ribosome shunting ocurre dentro de los 216-nucleótidos en la región 5’ UTR del mRNA HSP70 humano, estimulando su traducción durante heat shock.

20. ¿Existe una explicación alternativa para es que esta región 5’UTR cIAP2 pueda traducir de una manera cap-dependiente? Estas estructuras fueron muy bien conservadas en los transcriptos de algunos cIAP2 ortólogos.

21. Objetivo 2 • Determinar si el gen cIAP2 es traducido mediante ribosome shunting. • Para ello, se realizaron cambios en las estructuras características del 5’UTR necesarias para este mecanismo (deleciones, mutaciones, etc), en CaMV. • Se utilizaron construcciones con el 5’UTR modificado río arriba del gen de Fluc.

22. Esquema del experimento

23. Resultados • Región doble cadena que forma un stem estable en 5’UTR es esencial para el ribosome shunting, facilitando la translocación del ribosoma desde el sitio donor hasta el aceptor. • Se delecionaron 55 nt de la misma. LA TRADUCCIÓN EN UN 90 %

24. Para confirmar que esta disminución en la eficiencia de la traducción se debía a una pérdida en la estabilidad del stem, se cambiaron tres G por C en la base del mismo. Resultados LA TRADUCCIÓN EN UN 75 % El apareamiento estable en esta región es esencial para la eficiencia de traducción de cIAP2

25. El Ribosome shunting en CaMV requiere la traducción de un uORF corto localizado inmediatamente río arriba del stem. Para evaluar el efecto de este uORF, se cambió el AUG del uORF2 por AUC. Resultados LA TRADUCCIÓN EN UN 63% IN VITRO Y 81% IN VIVO La traducción de un ORF corto localizado inmediatamente río arriba del stem, cumple un rol crítico facilitando la traducción de cIAP2

26. A continuación se delecionaron los primeros 1230 nt del 5’UTR, reduciendo su largo original en un 44%. Hipótesis: la traducción se vería altamente reducida, ya que se removería el sitio donor de shunt completo, el uORF2 y una primera porción del stem. Resultados LA TRADUCCIÓN EN UN 60-65% Se observa una disminución menor a la esperada. Es posible que la mutante haya utilizado un camino alternativo menos eficiente de shunting. Todavía quedan 27 AUG y varias estructuras stem menores, que inhibirían el scanning común. Trabajos anteriores demostraron que estas dos características son necesarias y suficientes para mantener bajos niveles de traducción constitutiva.

27. Se quiere investigar el comportamiento del ribosoma al enfrentar el stem. El mismo puede seguir traduciendo a lo largo de la estructura tridimensional, o bien saltarla para reubicarse río abajo de ésta. • Se hibridó un primer de DNA específico contra una región definida del 5’UTR, cercana a los dominios 3 y 4. • Se trató con RNasa H con fines de degradar esta corta región de RNA complementaria y generar un RNA no contiguo. Resultados El tratamiento con RNasa no afectó la eficiencia de traducción, demostrando que el ribosoma se translocaría al RNA contiguo para continuar con el proceso de traducción, en lugar de scanear el stem. DATA NOT SHOWN.

28. El uORF2 en el 5’UTR facilita la traducción. • A continuación se quiso analizar el efecto de uORF1. • Se agregó una base para crear un corrimiento del marco de lectura que aumentara el largo de uORF1 de 19 a 37 codones. • La traducción en esta mutante provocaría un bypass del uORF2 y el sitiodonor de shunting, terminando 17 pares de bases río abajo del uORF2. Resultados LA TRADUCCIÓN IN VIVO EN SÓLO UN 25%. • Hipótesis: • La mayoría de los ribosomas bypasseó al ORF1 para comenzar la traducción • río abajo del ORF2. • La traducción de un ORF1 elongado permite el shunting en algún punto río • abajo del ORF2, indicando que, ni el producto del ORF1 ni su largo, afectarían la traducción de ORF2 • Conclusión: dado el pobre contexto de iniciación en el que se encuentra ORF1 • y que al parecer ORFs más cortos favorecen el shunting, la primer hipótesis • resulta más probable.

29. El 5’UTR de cIAP2 comprende dos exones. • El primero tiene 109 bases y contiene el start de uORF1. • El segundo tiene 3507 bases, incluye los sitios donor y aceptor y los primeros • nucleótidos de uORF2. • Para estudiar el efecto de esta región sobre la eficiencia traduccional, se delecionó • el exón 1. Resultados LA TRADUCCIÓN EN UN 20% Si bien la presencia de uORF1 inhibiría en teoría la traducción de uORF2, parece existir algo en el exón 1 que facilita este proceso.

30. Una estructura adicional de 2,48 kb que incluye 62 AUG y el dominio 3, queda por fuera del stem y probablemente sea bypasseada por los ribosomas. • Para analizar el rol de esta estructura en el shunting, se delecionó completamente,adicionando un hairpin estable que bloquee el scanning convencional, por encima del stem. Resultados LA TRADUCCIÓN EN UN 90% No solo el stem es necesario para el shunting, sino que la secuencia adicional de 2,48 kb , jugaría un rol imprescindible.

31. El dominio 3 es una estructura conservada del 5’UTR de cIAP2 dentro de los mamíferos. • Se delecionó el dominio 3 completo para analizar su importancia. • Además, se delecionaron dos dominios no conservados, “4+5”. Resultados • La deleción del dominio 3 produjo una inhibición de la traducción del 80% • La deleción de los dominios “4+5” no produjo alteraciones en la eficiencia • traduccional.

32. Por último, se examinó si la localización del codón de inicio de cIAP2 era • crítica para mantener la eficiencia traduccional. • Las construcciones mutantes tenían el AUG de cIAP2 seis codones río • arriba del AUG de FLuc. • La deleción del codón de inicio de cIAP2 provocaría que el ribosoma comenzara • la traducción 18 nt río abajo. Resultados • No se observaron diferencias significativas en la eficiencia de traducción entre • la mutante y el control. • Esto sugeriría que la posición del codón de inicio de cIAP2 no es relevante y que, luego del aterrizaje, el ribosoma podría scannear el RNA en busca del siguiente AUG en buen contexto de inicio.

33. Objetivo 3 • Determinar si ocurre modulación de la traducción mediada por la región 5´ no codificante de cIAP2 en situaciones de estrés celular. • Determinar regulación a nivel traduccional de la expresión del gen endógeno cIAP2 en situaciones de estrés. • Evidencias: en situaciones de estrés, la traducción convencional mediada por escaneo dependiente de cap es inhibida; se activan mecanismos alternativos de iniciación de la traducción de proteínas implicadas en la respuesta celular al estrés.

34. ¿El shunting es modulado por estrés? Para inducir estrés celular utilizan drogas que causan distintos efectos: • Etoposida: inhibe la actividad de la enzima topoisomerasa II, lo cual lleva al daño del DNA y a la activación de p53. La activación de p53 causa la desfosforilación de 4E-BPI que ahora puede secuestrar al factor de inicio de la traducción eIF4E, inhibiendo la traducción general.

35. ¿El shunting es modulado por estrés? Para inducir estrés celular utilizan drogas que causan distintos efectos: • Thapsigargin: inhibe la actividad de la familia de bombas Ca2+ ATPasas del retículo endoplasmático. Induce la respuesta de proteínas no plegadas por el aumento de Ca2+ citoplasmático. Esta respuesta lleva a la fosforilación de la subunidad α del factor de iniciación eIF2, inhibiendo la traducción general.

36. ¿El shunting es modulado por estrés? Para inducir estrés celular utilizan drogas que causan distintos efectos: • NaArs (arsenito de sodio): citotóxico y carcinogénico. Aumenta el estrés oxidativo e inhibe la reparación del DNA; a altas concentraciones puede llevar a la fosforilación de eIF2α. A bajas concentraciones puede, sin embargo, aumentar el metabolismo celular. • H2O2: aumenta el estrés oxidativo llevando al aumento de Ca2+ citoplasmático, lo cual induce la rápida fosforilación de eIF2α.

37. ¿El shunting es modulado por estrés? mRNA reportero que contiene un 5´UTR corto. Permite ver inicio de la traducción por escaneo convencional. mRNA reportero que contiene la región 5´ UTR cIAP2 Co- transfectan con estos mRNAs capeados y poliadenilados células MCF-7 (carcinoma mamario) y 293T, que luego fueron tratadas con las drogas que inducen estrés. Miden eficiencia de la traducción.

38. NaArs Etoposida Modulación de la traducción por estrés mediada por cIAP2 5´UTR Ambas drogas estimulan la transcripión mediada por cIAP2 5`UTR, con poco cambio en la traducción por escaneo convencional, que no resulta inhibida. Este tipo celular es más sensible al tratamiento con etoposida, que en este caso inhibe la traducción general. Sin embargo, la traducción de p-cIAP2-FL disminuye más lentamente que la de p-FL

39. Modulación de la traducción por estrés mediada por cIAP2 5´UTR No todas los agentes que inducen estrés llevan al aumento de la traducción mediada por cIAP2 5´UTR

40. Thapsigargin H2O2 Modulación de la traducción por estrés mediada por cIAP2 5´UTR En estos casos, al aumentar la concentración de las drogas, disminuye la traducción mediada por cIAP2 5´UTR, mientras que, en la mayoría de los casos, la traducción general se mantiene constante

41. Modulación de la traducción por estrés mediada por cIAP2 5´UTR Control de estabilidad de los mensajeros transfectados

42. Modulación de la traducción por estrés mediada por cIAP2 5´UTR Nuevas construcciones: • ΔDom3: deleción del dominio 3, mostrado como esencial para el shunting (¿unirá alguna proteína que modula la eficiencia de la traducción durante situaciones de estrés?) • ΔDom 4+5: deleción de los dominios 4 y 5, poco conservados y no esenciales para el shunting. Luego de transfectadas con los mensajeros, tratan a las células con etoposida.

43. Modulación de la traducción por estrés mediada por cIAP2 5´UTR

44. Modulación de la traducción por estrés mediada por cIAP2 5´UTR • Con etoposide aumenta la traducción mediada por cIAP2 5´UTR wild-type. • Sin etoposide, la deleción del dominio 3 disminuye la eficiencia de traducción, según lo ya visto. Sin embargo, con etoposida, esta deleción no impide que se induzca la traducción. • La deleción de los dominios 4 y 5 no produce cambios en la eficiencia de la traducción con o sin etoposida.

45. ¿Qué pasa con la expresión de la proteína endógena? Hasta ahora sólo miran qué pasa con mensajeros aportados de forma exógena. Ahora van a mirar qué pasa con la expresión de la proteína cIAP2 endógena. Tratan células 293T con etoposida, thapsigargin y NaArs; hacen un inmunoblotting.

46. Modulación de la traducción por estrés de cIAP2 endógena Tumor necrosis factor α: usado como control positivo. Se sabe que aumenta el nivel de cIAP2 por activación transcripcional • De acuerdo a lo visto antas, etoposida y NaArs aumentan la expresión de la proteína. • De acuerdo a lo visto antes, thapsigargin reduce la expresión de la proteína.

47. Modulación de la traducción por estrés de cIAP2 endógena En el experimento anterior sólo miran nivel de proteína, de modo que no se puede discriminar la regulación a nivel traduccional de la regulación a nivel transcripcional. Evidencias: en situaciones de estrés se remueven por splicing estructuras secundarias complejas de regiones 5´UTR, lo que aumenta la eficiencia de traducción mediada por escaneo convencional. Además se ha registrado un transcripto de cIAP2 que contiene un 5´UTR de sólo 223 nt. Para descartar que esto este sucediendo en el siguiente experimento realizan Northern blotting y RT-PCR. Analizan cuatro tipos celulares: 293T, HeLa (carcinoma cervical), Jurkart (células T) y MCF-7.

48. Modulación de la traducción por estrés de cIAP2 endógena Northern: la sonda reconoce la región C- terminal RT-PCR: los primers amplifican la región 5´UTR • En todos los tipos celulares se observa un único mRNA de cIAP2 de 5,5 a 6 Kb. • Con los agentes que inducen estrés celular no se observan cambios en cuanto al tamaño y cantidad de mensajero.

49. CONCLUSIONES • El extremo 5’UTR de cIAP2 regula su traducción por un mecanismo de ribosome shunting y no mediante un elemento IRES. • Este es el primer ejemplo de un transcripto de mamífero, ya sea eucariótico o viral, que se traduce exclusivamente por este método. • La eficiencia del shunting en el 5’UTR de cIAP2 requiere de estructuras características: un CAP; un uORF de tres codones en el sitio donor de shunt; una estructura tridimensional estable de RNA doble cadena río abajo del uORF. • Se cree que el dominio 3 involucra el reclutamiento de proteínas de unión a RNA o componentes de la maquinaria traduccional, pero queda por ser comprobado. • La inducción de la traducción por estrés no depende los dominios 3, 4 o 5. El dominio 3 parece facilitar sólo la traducción constitutiva. • La ventaja del shunting es que permite a la célula modular rápidamente la expresión de cIAP2 en condiciones de stress.

50. Es probable que el shunting de cIAP2 sea preferentemente inhibido por • condiciones de stress que induzcan la fosforilación del factor de inicio de la • traducción eIF2α, impidiendo que se reinicie el complejo ternario e inhibiendo • la traducción. • La etoposida inhibe la traducción por un mecanismo que promueve el • secuestro de eIF4E. Sin embargo este mecanismo no logra explicar la inducción • de la traducción de cIAP2 en su totalidad, ya que luego de tratar las células • durante 6 hs se recupera el scanning convencional. • Es probable que la etoposida induzca la activación o expresión de factores • activadores de shunting. • Mirando lo que ocurre con un reportero se concluye que agentes que inducen • estrés aumentan la traducción mediada por cIAP2 5´UTR. Esto no se ve con • todas las drogas. • Situaciones de estrés inducen la expresión de la proteína cIAP2 endógena • por aumento de la traducción, no por aumento de la transcripción o cambios en • el patrón de splicing. • El próximo paso para investigar la modulación del shunting de cIAP2 en stress • sería la búsqueda de proteínas que se unan al 5’UTR en presencia y ausencia • de stress celular.