Metody identifikace DNA RFLP, PCR a RAPD

1. Metody identifikace DNA RFLP, PCR a RAPD

2. Molekulární biologie • * 50. léta 20. století • popis struktury DNA (J. D. Watson, F. Crick) • stavba a vztah biomolekul k funkcím a vlastnostem organizmů

3. Genetické markery • genetické markery = značky, ukazatele se silnou genetickou kontrolou, neovlivněnou prostředím • morfologické markery (barva květu) • biochemické markery (přítomnost určitých látek v rostlině podmiňují geny -> přítomnost látky dokazuje přítomnost genu) • molekulární markery (analýzy DNA ) • DNA markery

4. Molekulární markery • umožňují identifikaci organizmu • stanoví příbuzenské vztahy • Výhoda DNA markerů: rychlá a spolehlivá determinace

5. RFLPRestriction Fragment Lenght Polymorphism(polymorfizmus v délce restrikčních fragmentů) • základní princip metody • štěpení celkové DNA na fragmenty pomocí restrikčních endonukleáz • elektroforetické rozdělení fragmentů dle délky • přenos fragmentů na membránu • hybridizace DNA

6. Štěpení celkové DNA na fragmenty pomocí restrikčních endonukleáz • restrikční endonukleázy - enzymy izolované z bakterií • jméno podle názvu bakterie, z které byl izolován (např.:EcoRI - Escherischia coli, AluI - Arthrobacter luteus) • rozeznávají určitou sekvenci DNA a podle ní DNA specificky štěpí • tato sekvence DNA tvoří palindrom - je symetrická kolem centrálního bodu • sekvence sestává nejčastěji z 4 bp (base pair - pár bází) nebo 6 bp EcoRI - AluI -

7. Elektroforetické rozdělení fragmentů DNA podle jejich délky • elektroforéza obecně metoda pomocí níž lze rozdělit makromolekuly , resp. fragmenty DNA, podle jejich délky • princip - makromolekuly s elektrickým nábojem se v elektrickém poli pohybují k jedné z elektrod v závislosti na své relativní molekulové hmotnosti, celkovém náboji a tvaru • stejně dlouhé fragmenty DNA se v elektrickém poli pohybují stejně rychle a vytvoříproužek

8. Přenos fragmentů na membránu • fragmenty DNA je nutné před přenosem (nebo během přenosu) na membránu denaturovat • denaturací se rozumí rozpletení dvouřetězce DNA ve dva jednořetězce DNA • na gel je přiložena nylonová membrána na níž je specifickým způsobem otisknuta DNA

9. Hybridizace se značenou sondou (Southernova metoda) • renaturace- proces vzniku dvouřetězcové DNA z jednořetězcových vláken • hybridizace – renaturace s dvojím původem jednořetězcové DNA • membrána s navázanou DNA se ponoří do roztoku jednořetězcové DNA, která je radioaktivně značena, tzv. sonda • sonda je krátká (150 - 8000 bází) a homologická (alespoň z větší části), aby k hybridizaci vůbec došlo • sonda se navazuje jen na místa s komplementárním řetězcem • po umytí a usušení je membrána přiložena na rentgenový film a ponechá se exponovat, film zčerná v místech, kde je navázána sonda

10. Pattern • elektroforetický profil (pattern)

11. Interpretace RFLP • porovnávání restrikčních fragmentů vzniklých štěpením odpovídajících úseků DNA • pattern • restrikční mapa - náročná záležitost • studium na úrovni rodů, druhů částečně poddruhů, nevhodnost při studiu mezi blízce příbuznými populacemi, nebo dokonce v rámci populace

12. Zhodnocení metody RFLP KLADY • vysoká reprodukovatelnost pattern • vysoká interpretovatelnost ZÁPORY • náklady • bezpečnost práce (radioaktivní materiál) • velké množství DNA • množství sondy • vysoce kvalifikovaný personál

13. PCRPolymerase Chain Reaction(polymerázová řetězová reakce) - vyvinuto v 80. letech 20. století - jedna z nejpoužívanějších metod molekulárně genetické diagnostiky základní princip metody • in vitro synéza vybraného úseku DNA, která probíhá v mnoha opakujících se cyklech • fragmenty nasyntetizované během reakce lze pozorovat na agarózovém gelu • možno analyzovat i velmi malé množství DNA

14. PCR - teplotní fáze 1. teplotní fáze 95 °C - denaturacezvýšením teploty dojde k oddělení obou řetězců dvoušroubovice od sebe (řetězce jsou k sobě poutány vodíkovými můstky, dodání energie zapříčiní zánik těchto vazebných interakcí) 2. teplotní fáze 35 - 65 °C – annealing ochlazení umožní přisednutí primerů k homologním místům a vytvoření krátkých dvoušroubovic DNA 3. teplotní fáze 72 °C – polymerace upravením teploty (zvýšením) na hodnotu vhodnou pro působení DNA polymerázy dochází k prodlužování dvoušroubovice DNA (5´  3´) až po začátek další denaturace (nového cyklu)

15. Průběh PCR • daný fragment DNA přibývá exponenciální rychlostí (2n= počet fragmentů po n cyklech) • v praxi se používá cca 30 cyklů, při nichž dojde k vyčerpání reakčních složek a růst se zastavuje poznámka: billion je v češtině miliarda

16. Zhodnocení metody PCR KLADY • levnější a technologicky snazší oproti RFLP • malé množství zpracovávané DNA ZÁPORY • vysoká čistota práce (případná kontaminace vzorku cizí DNA se fatálně projeví) • nutnost znalosti sekvencí v bezprostředním sousedství úseku DNA, který chceme pomnožit (syntéza primerů)

17. RAPDRandom Amplification of Polymorphic DNA • jedná se o modifikaci PCR • Nevyžaduje znalost cílové sekvence DNA • Významná pro systematickou a populační biologii

18. Některá specifika metody RAPD oproti klasické metodě PCR • R v názvu, zkracuje random, znamenající náhodný, protože výběr úseku, který bude pomnožen je ponechán náhodě • v reakční směsi je přítomen pouze jeden primer o délce deseti nukleotidů • reakční podmínky jsou odlišné (teplota 2. teplotní fáze je nižší (ca 34 °C), počet cyklů je vyšší (40 - 45 cyklů))

19. Zhodnocení metody RAPD KLADY • použitelnost pro jakýkoliv (neznámý) genom • technologicky jednoduchá a rychlá metoda • výsledky lze dobře kvantifikovat (sestavení matice a statistické zpracování) ZÁPORY • nízká specifita reakce, nereprodukovatelnost výsledků mezi laboratořemi (lze srovnávat jen interpretace) • lze hodnotit maximálně dva blízce příbuzné druhy (použití především v populační biologii)

20. Molekulární markery v lesnictví • Identifikace cizorodého organismu (parazita, mykorrhizy apod.) • Příbuzenské vztahy a původ • Deklarace vlastností sadebního materiálu • Markery spojené s biotickými nebo abiotickými stresy

21. Nejvýznamnější zdroje informací • www.ueb.cas.cz/download/manual.rtf • http://www.silvarium.cz/lesprace/03/01/clanek12_vyzkum.html • http://botany.natur.cuni.cz/fer/markers/Markery3-DNA,PCR,RAPD.pdf • http://botany.natur.cuni.cz/fer/markers/Markery5-RFLP,cpDNA.pdf

22. Děkujeme za pozornost.