Metody identifikace DNA –RFLP, PCR a RAPD

1. Metody identifikace DNA –RFLP, PCR a RAPD Jiří Zadina, Klára Polesná

2. Zařazení metod • genetické markery (značky, ukazatele s tak silnou genetickou kontrolou, kterou neovlivňuje prostředí) • morfologické markery • barva květu • biochemické markery • za přítomnost určitých látek v těle rostlin mohou geny, pokud prokáži přítomnost látky prokáži i přítomnost genu • molekulární markery (DNA markery) • analýzy DNA

3. RFLP • restriction fragment lenght polymorphism • polymorfizmus v délce restrikčních fragmentů • základní princip metody • štěpení celkové DNA na fragmenty pomocí restrikčních endonukleáz • elektroforetické rozdělení fragmentů dle délky • přenos fragmentů na membránu • hybridizace se značenou sondou

4. RFLP - I. štěpení celkové DNA na fragmenty pomocí restrikčních endonukleáz

5. Štěpení celkové DNA na fragmenty pomocí restrikčních endonukleáz • restrikční endonukleázy jsou enzymy izolované z bakterií • jméno podle názvu bakterie, z které byl izolován (např.: EcoRI - Escherischia coli, AluI - Arthrobacter luteus) • rozeznávají určitou sekvenci DNA a podle ní DNA specificky štěpí • tato sekvence DNA tvoří palindrom - je symetrická kolem centrálního bodu • sekvence sestává nejčastěji z 4 bp (base pair - pár bází) nebo 6 bp EcoRI - AluI -

6. RFLP - II. elektroforetické rozdělení fragmentů dle délky

7. Elektroforetické rozdělení fragmentů DNA podle jejich délky • elektroforéza je obecně metoda pomocí níž lze rozdělit makromolekuly (v našem případě fragmenty DNA) podle jejich délky • princip - makromolekuly s elektrickým nábojem se v elektrickém poli pohybují k jedné z elektrod v závislosti na své relativní molekulové hmotnosti, celkovém náboji a tvaru • stejně dlouhé fragmenty DNA se v elektrickém poli pohybují stejně rychle a vytvoří proužek

8. Elektroforetické rozdělení fragmentů DNA podle jejich délky • výsledek není pouhým okem patrný a proto se gel, na němž elektroforéza probíhá musí specificky barvit a vyzualizovat • u dlouhého genomu tvoří výsledek souvislá šmouha na níž jednotlivé fragmenty nerozlišíme a tím pádem je jakákoliv případná analýza genomu vyloučena

9. RFLP - III. přenos fragmentů na membránu

10. Přenos fragmentů na membránu • fragmenty DNA je nutné před přenosem (nebo během přenosu) na membránu denaturovat • denaturací se rozumí rozpletení dvouřetězce DNA ve dva jednořetězce DNA • na gel je přiložena nylonová membrána na níž je specifickým způsobem otisknuta DNA

11. RFLP - IV. hybridizace se značenou sondou

12. Hybridizace se značenou sondou (Southernova metoda) • proces vzniku dvouřetězcové DNA z jednořetězcových vláken se nazývá renaturace, pochází-li jednořetězcová DNA ze dvou různých zdrojů mluví se o hybridizaci • membrána s navázanými fragmenty jednořetězců DNA se ponoří do roztoku jednořetězcové DNA, která je radioaktivně (či jinak značena), takto značená DNA se nazývá sonda • sonda je krátká (150 - 8000 bází) a homologická (přinejmenším z větší části), aby k hybridizaci vůbec došlo • sonda se navazuje jen na místa, kde se nalézá komplementární řetězec • po umytí a usušení je membrána přiložena na rentgenový film a ponechá se exponovat, film zčerná v místech, kde je navázána sonda

13. Hybridizace se značenou sondou (Southernova metoda)

14. Hybridizace se značenou sondou (Southernova metoda)

15. Hybridizace se značenou sondou (Southernova metoda)

16. Pattern • elektroforetický profil (pattern)

17. Interpretace RFLP • porovnávání restrikčních fragmentů vzniklých štěpením odpovídajících úseků DNA • pattern • restrikční mapa - náročná záležitost • studium na úrovni rodů, druhů částečně poddruhů, nevhodnost při studiu mezi blízce příbuznými populacemi, nebo dokonce v rámci populace

18. Interpretace RFLP • A - divoký kmen (nemutovaný) • B - mutace - ztráta restrikčního místa • C - mutace - nové restrikční místo • D - mutace - delece (ztráta úseku DNA) • E - mutace - inserce (vmezeření nového úseku DNA)

19. Zhodnocení metody RFLP + • vysoká reprodukovatelnost pattern • vysoká interpretovatelnost – • velké náklady • bezpečnost práce (radioaktivní materiál) • potřeba velkého množství DNA • nutnost mít velké množství sondy • vysoce kvalifikovaný personál

20. PCR • polymerase chain reaction • polymerázová řetězová reakce • základní princip metody • namnožení části DNA v podmínkách IN VITRO pomocí cyklického střídání tří teplotních fází

21. PCR - potřebné komponenty • vzorek DNA • velmi malé množství zkoumané DNA (ca ng) • deoxynukleotidtrifosfáty • dATP, dTTP, dCTP a dGTP (jde o báze (A, T, C a G) navázané na cukr deoxyribózu a trifosfát, který dodává energii (DNA se skládá z bází, deoxyribózy a fosfátu), z těchto stavebních jednotek bude namnožen určitý úsek DNA • DNA polymeráza • Taq - termostabilní polymeráza (enzym izolovaný z bakterie Thermus aquaticus žijící v horkých pramenech snášející vysoké teploty (blížící se 100 °C)) množící úsek DNA • primery (2 různé) • známý oligonukleotid - určitá sekvence DNA o délce 10 - 40 nukleotidů, která je homologní ke zkoumanému vzorku DNA • primery vymezují zkoumaný úsek DNA • vhodný pufr • stabilizace reakčního prostředí

22. Replikace DNA • dvoušroubovice DNA má antiparalelní strukturu • prodlužování řetězce DNA ve směru 5´  3´

23. PCR - 1. teplotní fáze • 1. teplotní fáze 95 °C - denaturace • zvýšením teploty dojde k oddělení obou řetězců dvoušroubovice od sebe (řetězce jsou k sobě poutány vodíkovými můstky, dodání energie zapříčiní zánik těchto vazebných interakcí)

24. PCR - 2. teplotní fáze • 2. teplotní fáze 35 - 65 °C annealing • ochlazení umožní přisednutí primerů k homologním místům a vytvoření krátkých dvoušroubovic DNA

25. PCR - 3. teplotní fáze • 3. teplotní fáze 72 °C - polymerace • upravením teploty (zvýšením) na hodnotu vhodnou pro působení DNA polymerázy dochází k prodlužování dvoušroubovice DNA (5´  3´) až po začátek další denaturace (nového cyklu)

26. Průběh PCR

27. Průběh PCR • daný fragment DNA přibývá exponenciální rychlostí (2n= počet fragmentů po n cyklech) • v praxi se používá ca 30 cyklů, při nichž dojde k vyčerpání reakčních složek a růst se zastavuje poznámka: billion je v češtině miliarda

28. Další zpracování PCR • namnožený vzorek DNA se elektroforeticky zpracuje, čímž se zjistí délka fragmentů, z nichž se vzorek skládá (fragmenty jsou stejně dlouhé a vytvoří dobře zachytitelný proužek) • výsledek elektroforézy není pouhým okem patrný, proto se DNA specificky barví EtBr (ethidium bromidem), který se díky své struktuře vloží dovnitř dvoušroubovice a po ozáření UV světlem oranžově fluoreskuje, zmíněné se fotografuje a dále hodnotí • výstupy PCR nacházejí významné uplatnění v taxonomii a populační biologii

29. Zhodnocení metody PCR + • oproti RFLP levnější a technologicky snazší • malé množství zpracovávané DNA – • vysoká čistota práce (případná kontaminace vzorku cizí DNA se fatálně projeví) • nutnost znalosti sekvencí v bezprostředním sousedství úseku DNA, který chceme pomnožit (syntéza primerů)

30. RAPD • random amplification of polymorphic DNA • jedná se o modifikaci PCR

31. Některá specifika metody RAPD oproti klasické metodě PCR • R v názvu, zkracuje random, znamenající náhodný, protože výběr úseku, který bude pomnožen je ponechán náhodě • v reakční směsi je přítomen pouze jeden primer o délce deseti nukleotidů • reakční podmínky jsou odlišné (teplota 2. teplotní fáze je nižší (ca 34 °C), počet cyklů je vyšší (40 - 45 cyklů))

32. Zhodnocení metody RAPD + • použitelnost pro jakýkoliv (neznámý) genom • technologicky jednoduchá a rychlá metoda • výsledky lze dobře kvantifikovat (sestavení matice a statistické zpracování) – • nízká specifita reakce, nereprodukovatelnost výsledků mezi laboratořemi (lze srovnávat jen interpretace) • lze hodnotit maximálně dva blízce příbuzné druhy (použití především v populační biologii)

33. Nejvýznamnější zdroje informací • www.ueb.cas.cz/download/manual.rtf • http://botany.natur.cuni.cz/fer/markers/Markery3-DNA,PCR,RAPD.pdf • http://botany.natur.cuni.cz/fer/markers/Markery5-RFLP,cpDNA.pdf • Ferák, V. et Sršeň, Š. (1990): Genetika človeka, SPN, Bratislava, 447 s.

34. Děkujeme za pozornost.