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Leistungspotentiale und Grenzen mikrobiologischer Methoden – dargestellt anhand konkreter Beispiele. muva kempten Dr. Monika Knödlseder. Beispiele: Bifidobakterien Laktobazillen Cronobacter PCR. Bifidobakterien. Bifidobakterien. werden häufig in probiotischen Produkten eingesetzt

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Presentation Transcript
Leistungspotentiale und grenzen mikrobiologischer methoden dargestellt anhand konkreter beispiele

Leistungspotentiale und Grenzen mikrobiologischer Methoden – dargestellt anhand konkreter Beispiele

muva kempten

Dr. Monika Knödlseder


  • Beispiele: – dargestellt anhand konkreter Beispiele

    • Bifidobakterien

    • Laktobazillen

    • Cronobacter

    • PCR


Bifidobakterien – dargestellt anhand konkreter Beispiele


Bifidobakterien
Bifidobakterien – dargestellt anhand konkreter Beispiele

  • werden häufig in probiotischen Produkten eingesetzt

  • keine „offizielle“ spezifische Nachweismethode für Bifidobakterien

  • ISO-Vorschlag in Bearbeitung ISO/FDIS 29981/IDF 220:2009 (E)


Bifidobakterien1
Bifidobakterien – dargestellt anhand konkreter Beispiele

  • ISO/FDIS 29981/IDF 220:2009 (E)

    • Für Milchprodukte

    • IDF – Ringversuch 2006 21 Labore (Europa, Japan und Neuseeland)

    • Nährboden TOS-MUP Medium TOS Agar mit Li Mupirocin (MUP)

      • Begleitflora wird gehemmt (Streptococcus thermophilus, Laktobazillen)

      • Wachstum von Bifidobakterien wird gefördert


Bifidobakterien2
Bifidobakterien – dargestellt anhand konkreter Beispiele

Nachweis mit TOS-MUP-Agar:

Probe: Milchprodukte (z.B. Milchpulver, Starterkultur)

Herstellen der Verdünnungsreihe

je 2 x 1 ml Probe oder Verdünnung Gussplattenverfahren

12 - 15 ml TOS-MUP-Agar

Inkubation: 72 ± 3 Std. bei 37 ± 1°C, anaerob

  • Bestätigung und Zählen der Kolonien:

    Koloniemorphologie:

    Alle gewachsenen Kolonien werden gezählt

    Pro Kolonietyp -> mikroskopische Bestätigung der Bifidobakterienreinkultur

    Evtl. F6PPK Assay

    Zählen der Kolonien und Berechnung der Keimzahl:

  • Alle Platten mit ≤ 300 Gesamt-Kolonien

  • Bifidobakterienstämme können unterschiedliche Koloniegrößen und Koloniemorphologien auf dem Nährmedium zeigen


Bifidobakterien3
Bifidobakterien – dargestellt anhand konkreter Beispiele

Nachweis von Bifidobakterien: Koloniemorphologie

TOS-MUP-Agar, 37°C, 72 Std.


Bifidobakterien4
Bifidobakterien – dargestellt anhand konkreter Beispiele

Nachweis von Bifidobakterien - Methodenvergleich

  • Methode 1

  • muva-Methode

  • Nachweis mit RCM-Agar

  • Spatelverfahren

  • anaerob

  • Methode 2

  • ISO-Vorschlag

  • Nachweis mit TOS- MUP- Agar

  • Gussplattenverfahren

  • anaerob


Bifidobakterien5
Bifidobakterien – dargestellt anhand konkreter Beispiele

Nachweis von Bifidobakterien: Vergleichsuntersuchungen

hoher Anteil Begleit-flora auf RCM-Agar


Bifidobakterien6
Bifidobakterien – dargestellt anhand konkreter Beispiele

Zusammenfassung

ermittelte Keimzahlwerte beider Methoden sind vergleichbar, aber:


Bifidobakterien7
Bifidobakterien – dargestellt anhand konkreter Beispiele

  • Nachteil:

    • Bezug des Nährbodens in Japan

    • kein europäischer Anbieter (derzeit)


LAKTOBAZILLEN – dargestellt anhand konkreter Beispiele



Laktobazillen
Laktobazillen ?!

Nachweis von Laktobazillen –

Spatelverfahren mit MRS-Agar (nach VDLUFA M7.16.3, 2003)

Probe: fermentierte Milchprodukte, Molkereihilfsstoffe

Herstellen der Verdünnungsreihe

je 2 x 0,1 ml Probe oder Verdünnung - Spatelverfahren auf MRS - Agar pH 5,4

Inkubation: 72 ± 3 Std. bei 37 ± 1°C, anaerob

Bestätigung und Zählen der Kolonien:

- Jeden Kolonietyp bestätigen als Laktobazillen: -> Mikroskopie

-> KOH: negativ

-> Katalase: negativ

- Zählen der Platten (10 bis < 300 Gesamt-Kolonien)

  • Identifizierung der Spezies:

  • ggf. Identifizierung der Laktobazillen-Spezies mit Testsystem „api 50 CH“ (bioMerieux)

  • oder FTIR-Spektroskopie


Laktobazillen1
Laktobazillen ?!

gleiche Methode – unterschiedlicher Agar – „gleiche“ Ergebnisse

Maximale Abweichung: 23% 23% 25% 10% 28% 25%

Lb. acidophilus Lb. delbrueckii Probe 1

Lb. delbrueckii Probe 2

Lb. delbrueckii Probe 3

Lb. delbrueckii Probe 4


Laktobazillen2
Laktobazillen ?!

gleiche Methode – unterschiedlicher Agar – unterschiedliche Ergebnisse


Laktobazillen3
Laktobazillen ?!

gleiche Methode – unterschiedlicher Agar – unterschiedliche Ergebnisse

Kultur

Lb. delbrueckii

Joghurtproben mit Kultur

Lb. delbrueckii


Laktobazillen4
Laktobazillen ?!

Zusammenfassung:

  • Die Vergleichsuntersuchungen von über 80 Proben (4 Hersteller) mit Merck- und Difco-Agar

  • bei der Mehrheit (über 80%) der untersuchten Proben vergleichbare Keimzahl und FTIR-Identifizierungsergebnis


Laktobazillen5
Laktobazillen ?!

Zusammenfassung:

Aber:

  • in produktabhängigen Einzelfällen (4) führte die Verwendung unterschiedlicher MRS - Nährmedien zu deutlichen Abweichungen (über 80%) in der Keimzahl

  • bei ca. 95 % der Proben keine Abweichungen bei der FTIR - Analyse (identischen Spezies)

  • bei ca. 5 % der Proben keine eindeutige Übereinstimmung in der FTIR - Analyse (als Option)


Cronobacter – ?!E.sakazakii


Enterobacter sakazakii iso ts 22964 idf rm 210 2006
Enterobacter ?!sakazakiiISO/TS 22964IDF/RM 210:2006

Probe:-milk and milk products (milk powder and powdered infant formula) and -environmental samples collected from milk powder or infant formula factories

Inkubation bei 37 ± 1 °Cfür 18 h ± 2 h

gepuffertes Peptonwasser

Inkubation bei 44 ± 0,5°C für 24 ± 2 h

Selektive Anreicherung in mLST/Vanvomycin Medium

Ausstrich der mLST/vancomycin Kultur auf den chromogenen Selektivnährboden

Inkubation bei 44 ± 1°C für 24 ± 2 h

Bestätigungstests


Prüfmittel ?!

Bsp.: Inkubationstemperatur nicht eingehalten

Selektive Anreicherung bei 44 °C inkubiert

Selektive Anreicherung bei 46 °C inkubiert


Cronobacter
Cronobacter ?!

  • Technische Spezifikation ist derzeit in Überarbeitung

    • Optimierung des Verfahrens

    • Horizontales Verfahren

    • Derzeit in der Diskussion:

      • Inkubation der Selektivmedien 22-26 h bei 41,5 ± 1 °C

      • Austausch der Selektivmedien

        • Cronobacter screening broth (CSB) (anstelle mLST)

        • Chromogenic Cronobacter Isolation (CCI) agar (anstelle Enterobacter sakazakii isolation agar)



  • Hohe Spezifität ?!

  • Hohe Sensitivität

  • Zeitgewinn gegenüber kulturellen Verfahren in der Mikrobiologie

    Gesamtdauer mit Anreicherung 1-2 Tage gegenüber bis zu 10 Tagen für kulturelle Verfahren

  • Mit Multiplex - PCR mehrere Parameter gleichzeitig nachweisbar

  • Vielseitige Einsatzmöglichkeiten

    • Mikrobiologie

    • GMO

    • Tierartendifferenzierung

    • Pathologie……

Potential der

PCR


PCR / real – time PCR ?!

Wie geht man mit positiven Befunden um?

Was macht man, wenn der Keim nicht isoliert werden kann?


PCR ?!

Verordnung zur Durchführung von Vorschriften des gemeinschaftlichen Lebensmittelhygienerechts

  • Artikel 4: Verordnung mit lebensmittelrechtlichen Vorschriften zur Überwachung von Zoonosen und Zoonoseerregern (= Umsetzung der Richtlinie 2003/99/EG)

    (2) Im Falle des Nachweises von Zoonoseerregern sind….

    • Isolate der nachgewiesenen Zoonoseerreger herzustellen

    • die Rückstellproben des Probenmaterials

    • die Isolate

      • während eines von der zuständigen Behörde festzusetzenden Zeitraumes, jedoch nicht länger als drei Monate, in geeigneter Weise aufzubewahren

      • der zuständigen Behörde auf Verlangen vorzulegen und auszuhändigen.



Kompetenz des labors
Kompetenz des Labors ?!

  • Bei Beurteilungen alle Aspekte berücksichtigen

  • Laborkompetenz: Bsp.

    • Ringversuche

    • Interne Kontrollen

    • Prüfmittelüberwachung

    • Schulung - Laborbegehungen

      Qualitätssicherung im Labor

  • Mikrobiologisches Fachwissen


Vielen dank f r ihre aufmerksamkeit

Vielen Dank für Ihre Aufmerksamkeit! ?!

Unser Team:

Dr. Christine Bürk Dr. Ursula Hartmann

Marion Seidl Isolde Degle

Dr. Karlheinz Friedrich

Dr. Monika Knödlseder


  • 5.3 Chromogenic Cronobacter Isolation (CCI) agar ?!

  • 5.3.1 Composition

  • Tryptic digest of casein

  • Yeast extract

  • Sodium chloride (NaCl)

  • 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-α-D-glucopyranoside

  • Sodium desoxycholate (C24H39NaO4)

  • Ammonium iron(III) citrate (C6H8O7 Fe NH3)

  • Sodium thiosulfate (Na2S2O3)

  • Agar

  • Water

  • Kein Crystal violet


  • 5.2. ?!Cronobacter screening broth (CSB)

  • 5.2.1 Base medium

  • Enzymatic digest of animal tissues

  • Meat extract

  • Sodium chloride (NaCl) (weniger)

  • Bromocresol purple

  • Sucrose (C12H22O11)

  • Water

  • 5.2.2. Vancomycin solution


Bifidobakterien n hrmedien
Bifidobakterien –Nährmedien ?!

Nachweis von Bifidobakterien: Nährmedienzusammensetzung


Laktobazillen n hrmedien
Laktobazillen - Nährmedien ?!

Laktobazillen – Verwendung von MRS-Agar verschiedener Hersteller



  • Zählung der Kolonien und Angabe des Ergebnisses ?!:

  • Zählung der Verdünnungsstufen mit mindestens einmal > 15 bis 300 Kolonien

  • Alle Kolonien werden gezählt

  • Bildung des gewogenen arithmetischen Mittels der Keimzahlwerte von 2 aufeinanderfolgenden Verdünnungsstufen und Angabe des Ergebnisses als KbE /ml oder KbE/g

  • Sind in der Anfangsverdünnung weniger als 15 Kolonien gewachsen, werden alle Kolonien gezählt und das arithmetische Mittel gebildet


Kompetenz des labors1
Kompetenz des Labors ?!

  • Externes, akkreditiertes Labor: für die entsprechenden Untersuchungsverfahren akkreditiert? Erfahrung mit der entsprechenden Probenmatrix vorhanden?

  • Anerkanntes (akkreditiertes) Betriebslabor? Ist die Methode validiert? Nimmt das Labor erfolgreich an Ringversuchen/ Vergleichsuntersuchungen teil?

  • Welche Untersuchungsverfahren wurden eingesetzt? (Betriebsinterne Methoden; Referenz-, validierte Schnellmethoden)


Staphylokokken enterotoxine set verordnung eg 2073 2005 anhang i
Staphylokokken-Enterotoxine (SET), Verordnung (EG) 2073/2005, Anhang I

  • In der Praxis häufig als obligates Lebensmittelsicherheitskriterium eingestuft →

    Verweis auf Kapitel 2.2 des Anhangs:

    2.2.3. Käse aus Rohmilch2.2.4. Käse aus Milch, wärmebehandelt …..2.2.5. Frischkäse aus Milch … , wärmebehandelt ….2.2.7. Milch- und Molkepulver

    Bei Grenzwertüberschreitung: koagulasepositive Staphylokokken > 105 KBE/g

    Untersuchung auf Staphylokokken-Enterotoxine: negativ in 25 g


Nachweis von set problematik falschpositiver ergebnisse
Nachweis von SET- 2073/2005, Anhang IProblematik falschpositiver Ergebnisse

  • In Abhängigkeit vom verwendeten Testkit sind falschpositive Resultate möglich:

    es ist daher unumgänglich, insbesondere schwach verdächtige Ergebnisse zu verifizieren:

  • Zählung der Staphylokokken parallel zur SET-Bestimmung

  • Thermonuklease-Nachweis(Hinweis auf kritische Staphylokokken-Keimzahlen noch möglich in Proben, in denen keine Staphylokokken mehr nachweisbar sind)

  • Hitzebehandlung der Probe und erneute SET-Bestimmung (SET sind hitzestabil, unspezifische Reaktionen hervorrufende Substanzen sind häufig hitzelabil)

    (aus: H. Becker et al. (1994), Archiv für Lebensmittelhygiene 45; 25-48)


Eingesetzte Volumen für die PCR 2073/2005, Anhang I

  • Von 5 μl bis 1 ml

  • BAX 5 μl

  • Roche 1 ml

  • EHEC 1 ml


Verordnung zur durchf hrung von vorschriften des gemeinschaft lichen lebensmittel hygienerechts
Verordnung zur Durchführung von Vorschriften 2073/2005, Anhang Ides gemeinschaft-lichen Lebensmittel-hygienerechts

  • Artikel 4: Verordnung mit lebensmittelrechtlichen Vorschriften zur Überwachung von Zoonosen und Zoonoseerregern

  • § 3: Betriebseigene Kontrollen

  • (1) Wer im Rahmen von Kontrollen nach Artikel 3 Abs. 1 der Verordnung (EG) Nr. 2073/2005 ...... oder anderen betriebseigenen Kontrollen Lebensmittel auf Zoonoseerreger untersucht, hat zum Zweck der Durchführung von weitergehenden Untersuchungen

    • Rückstellproben des Probenmaterials anzufertigen und bis zum Vorliegen des Ergebnisses der Untersuchungen in geeigneter Weise aufzubewahren.


Bifidobakterien methoden vergleich
Bifidobakterien – Methoden- 2073/2005, Anhang Ivergleich

Nachweis von Bifidobakterien: Methodenvergleich detailliert

Bifidobakterien

Laktob.


Bifidobakterien vergleichsunter suchungen
Bifidobakterien – Vergleichsunter-suchungen 2073/2005, Anhang I

Nachweis von Bifidobakterien: Vergleichsuntersuchungen

hoher Anteil Begleit-flora auf RCM-Agar

Bei gut 80% der Proben lag die Abweichung der ermittelten Keimzahlwerte unter 40%


Laktobazillen nachweis
Laktobazillen - Nachweis 2073/2005, Anhang I

Nachweis von Laktobazillen –

Spatelverfahren mit MRS-Agar (nach VDLUFA M7.16.3, 2003)

Probe: fermentierte Milchprodukte, Molkereihilfsstoffe

Herstellen der Verdünnungsreihe

je 2 x 0,1 ml Probe oder Verdünnung im Spatelverfahren auf MRS-Agar pH 5,4 ansetzen

Inkubation: 72 ± 3 Std. bei 37 ± 1°C, anaerob

  • Bestätigung und Zählen der Kolonien:

  • - Jeden Kolonietyp bestätigen als Laktobazillen: -> Mikroskopie: sporenlose Stäbchen

  • -> KOH: negativ

  • -> Katalase: negativ

  • - Zählen der Platten mit i.d.R. 10 bis < 300 Gesamt-Kolonien

  • Bildung des arithmetischen Mittels von 2 aufeinanderfolgenden Verdünnungsstufen und

  • Angabe als KbE /ml oder KbE/g

  • Identifizierung der Spezies:

  • ggf. Identifizierung der Laktobazillen-Spezies mit Testsystem „api 50 CH“ (bioMerieux)

  • oder FTIR-Spektroskopie


Grenzen der mikrobiologie
Grenzen der Mikrobiologie: 2073/2005, Anhang I

  • fehlende Nachweismethode

  • trotz speziell angepasster Inkubationsbedingungen können (vorgeschädigte) Mirkoorganismen nicht (mehr) zum Wachstum gebracht werden

  • unterschiedliche Methoden zum Nachweis desselben Mikroorganismus können zu unterschiedlichen Ergebnisse führen

  • unterschiedliche Vorgehensweisen oder Reagenzien innerhalb einer Methode können zu unterschiedlichen Ergebnissen führen (Bsp: Laktobazillen)


Bifidobakterien nachweis

Probe: Milch, Milchprodukte, Molkereihilfsstoffe 2073/2005, Anhang I

Herstellen der Verdünnungsreihe

je 2 x 0,1 ml Probe oder Verdünnung im Spatelverfahren auf RCM-Agar pH 5,9 ansetzen

Inkubation: 72 ± 2 Std. bei 37 ± 1°C, anaerob

(bei Proben mit einem hohen Anteil Lactobacillus (para)casei: Inkubation bei 42°C)

  • Bestätigung und Zählen der Kolonien:

    Koloniemorphologie:

    porzellanweiße, leicht erhabene Kolonien mit einem Durchmesser von 1 bis 2 mm

    Bestätigungstests:

    • Mikroskopie: unregelmäßige Stäbchen, zum Teil knochenförmig, Enden zum Teil keulenförmig angeschwollen oder verzweigt.- KOH-Test: negativ (=grampositiv)

    • Katalase-Test: negativ

      Zählen der Kolonien und Berechnung der Keimzahl:

      - Alle Platten mit 10 bis < 300 Gesamt-Kolonien

  • Bildung des arithmetischen Mittels von 2 aufeinanderfolgenden Verdünnungsstufen und Angabe als KbE /ml oder KbE/g

Bifidobakterien- Nachweis

Methode 1 – Nachweis mit RCM-Agar:


Bifidobakterien nachweis1

Probe: Milch, Milchprodukte, Molkereihilfsstoffe 2073/2005, Anhang I

Herstellen der Verdünnungsreihe

je 2 x 1 ml Probe oder Verdünnung im Gussplattenverfahren

mit ca. 15 ml TOS-MUP-Agar (ca. 48°C, hitzesensibel!) ansetzen

Inkubation: 72 ± 4 Std. bei 37 ± 1°C, anaerob

  • Bestätigung und Zählen der Kolonien:

    Koloniemorphologie:

    Alle gewachsenen Kolonien werden gezählt

    Pro Kolonietyp -> mikroskopische Bestätigung der Bifidobakterienreinkultur (ggf. KOH und Katalase bei unklarer Mikroskopie)

    • Mikroskopie: unregelmäßige Stäbchen, zum Teil knochenförmig, Enden zum Teil keulenförmig angeschwollen oder verzweigt.- KOH-Test: negativ (=grampositiv)

    • Katalase-Test: negativ

      Zählen der Kolonien und Berechnung der Keimzahl:

      - Alle Platten mit 0 bis < 300 Gesamt-Kolonien

  • Bildung des arithmetischen Mittels von 2 aufeinanderfolgenden Verdünnungsstufen und Angabe als KbE /ml oder KbE/g

Bifidobakterien- Nachweis

Methode 2 – Nachweis mit TOS-MUP-Agar:


Leistungs potentiale
Leistungs-potentiale 2073/2005, Anhang I

Moderne Methoden :

  • PCR:

    • Salmonellenanalyse ca. 1,5 - 2 Tage

    • Listerienanalyse ca. 2 Tage

    • STEC ca. 2 Tage

    • Cronobacter ca. 2 Tage

  • FTIR Analyse:

    Absorption aller Zellbestandteile

    → Chemische Zusammensetzung des

    Keimes wird „dargestellt“

    → definierte Wellenlängenbereiche werden für einen „Fingerabdruck“ des Keims ausgewertet


Bifidobakterien zusammen fassung
Bifidobakterien – Zusammen-fassung 2073/2005, Anhang I

Nachweis von Bifidobakterien – Zusammenfassung

ermittelte Keimzahlwerte beider Methoden sind vergleichbar, aber:


Laktobazillen6
Laktobazillen 2073/2005, Anhang I


Probenahme planung
Probenahme-planung 2073/2005, Anhang I

  • Festlegen aussagefähiger Probenahmestellen, Beispiele:

    • Der zu untersuchende Probenteil: Käserinde bei der Untersuchung auf Listeria monocytogenes

    • Repräsentative Probenahme / Stichproben entsprechend Anlage 1 der Verordnung (EG) 2073/2005

    • „kritische“ Anlagenteile unter Berücksichtigung möglicher Biofilm- bzw. Nischenbildung

  • Festlegen relevanter Untersuchungsparameter, Beispiel:

    • Schmierlösung und Gully-Inhalte auf Listerien


Bifidobakterien kolonie morphologie
Bifidobakterien 2073/2005, Anhang I- Kolonie-morphologie

Nachweis von Bifidobakterien: Koloniemorphologie

RCM-Agar, 37°C, 72 Std.

TOS-MUP-Agar, 37°C, 72 Std.


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