1 / 54

A génaktivitás szabályozása

A génaktivitás szabályozása. Nem minden gén nyilvánul meg állandóan Sejt típusa (egérben ~200), sejtciklus állapota Minden sejttípusban ugyanaz a genetikai állomány (kevés kivétellel) Egy bizonyos géntermék szintézisét génszabályozási mechanizmusok ellenőrzik

chase
Download Presentation

A génaktivitás szabályozása

An Image/Link below is provided (as is) to download presentation Download Policy: Content on the Website is provided to you AS IS for your information and personal use and may not be sold / licensed / shared on other websites without getting consent from its author. Content is provided to you AS IS for your information and personal use only. Download presentation by click this link. While downloading, if for some reason you are not able to download a presentation, the publisher may have deleted the file from their server. During download, if you can't get a presentation, the file might be deleted by the publisher.

E N D

Presentation Transcript


  1. A génaktivitás szabályozása

  2. Nem minden gén nyilvánul meg állandóan • Sejt típusa (egérben ~200), sejtciklus állapota • Minden sejttípusban ugyanaz a genetikai állomány (kevés kivétellel) • Egy bizonyos géntermék szintézisét génszabályozási mechanizmusok ellenőrzik • A génaktivititást a transzkripció szinten • Szignálok kívülről, vagy sejten belülről • Ha kell ki/bekapcsolás

  3. A génexpresszió ellenőrzési pontjai • DNS átrendeződés – DNS szekvencia helye a genomban • Transzkripciós szabályozás – RNS szintézis iniciáció/termináció • RNS processzálás – splicing/alternatív splicing • Transzlációs szabályozás • mRNS stabilitás • Poszttranszlációs szabályozás – enzimaktivitás, aktiválás, stabilitás, stb.

  4. Prokarióták vs eukarióták • Prokarióták – maximális növekedés az adott körülmények között, kivéve, ha végzetes • Transzkripció és transzláció egyszerre, egy helyen (splicing nem) • Eukarióták – egyedfejlődés, osztódás és specializálódás • Felnőttben – fenntartás, tápanyagok nem változnak olyan drasztikusan

  5. Transzkripció szabályozása prokariótákban • Gyakran ki/be, csak akkor,ha a géntermék kell (A Ki leggyakrabban nagyon kicsi expressziót jelent (eukariótákban az egyedfejlődésnél)) • Koordinált szabályozás – egy, vagy több metabolizmus útvonal génjei együtt, policisztronos mRNS (eukarióta monocisztronos)

  6. Katabolizmus útvonalak (degradatív) • Indukálható, kis inducer molekula • Anabolikus útvonalak (bioszintézis) • Végtermék elég, represszálható enzimszintézis, kis korepresszor molekula

  7. Két fő kategória: negatív, pozitív szabályozás

  8. Indukálható rendszer: • Negatív szabályozás: a represszor fehérje megakadályozza a transzkripciót; az inducer antagonizálja a represszort; van transzkripció • Represszálható rendszer: aporepresszor+korepresszor=funkcionális represszor nincs transzkripció • Pozitív szabályozás: mRNS csak akkor, ha transzkripciós aktivátor kapcsolódik az aktiválandó gén megfelelő régiójához • Autoreguláció: fehérje a saját génjét +/-

  9. Laktóz metabolizmus és az operon • E. coli laktóz hasznosítás szabályozásának genetikai analízise • Lac-mutánsok • Két gén - β-galaktozidáz, laktóz permeáz – szükséges • Néhány száz Lac- mutáns: kromoszómán és F’lac-on • F’×F- mating = parciális diploidok; F’ lac- / lac+ és F’ lac+ / lac- = mind Lac+ • F’ lac- × lac- → Lac+ fenotípusra szelektálva 2 komplementációs csoport, legalább két gén (lacZ, lacY), legalább két gén! (LacA laktóz transzacetiláz később, mert nem esszenciális a laktóz hasznosításhoz.)

  10. F’lacY- lacZ+/lacY+lacZ-és F’lacY+lacZ-/lacY-lacZ+→ Lac+ fenotípus • F’lacY-laZ+/lacY-lacZ+és F’lacY+lacZ-/lacY+lacZ- → Lac- fenotípus lacZ → β-galaktozidáz lacY → laktóz permeáz • lacZ és lacY nagyon közel, kotranszdukcióval térképezve

  11. Génexpresszió baktériumokban – néhány fontos megkülönböztetés: Szabályozott gének Sejt növekedés és sejtosztódás szabályozása. Megnyilvánulásukat (expresszió) a sejt szükségletei és a környezet szabályozzák, szükség szerint, nem folyamatosan működnek. Konstitutív gének Folyamatosan kifejeződnek. Háztartási gének (housekeeping genes), mint pl. a fehérjeszintézishez és a glükóz metabolizmushoz szükséges gének. *Valamelyik szinten minden gén szabályozott!

  12. Operon – mi az? Gének csoportja (cluster), amelyeknek expresszióját operátor-represszor fehérje kölcsönhatás szabályozza, operátor régió és a promóter. • Egy operon részei: Promóter Represszor Operator (ellenőrző hely) Kódoló szekvenciák (gének, cisztronok, ORF-ek) Terminátor • Egymás melleti kódoló szekvenciák (pl., baktériumok, mtDNS) együtt íródnak át poligénes (policisztronos) mRNS-sé.

  13. Inducer és indukció: • Inducer = kémiai, vagy környezeti ágens, ami egy operon transzkripcióját iniciálja. • Indukció = géntermék(ek) szintézise az inducerre adott válaszként.

  14. Operon szerveződése

  15. E. coli lac operonja: • AzE. colia glükóz metabolizmus géneket folyamatosan kifejezi (konstitutív gének). • Az alternatív cukorok (pl. laktóz) metabolizmusa specifikusan szabályozott. • laktóz= diszaccharid (glükóz + galaktóz), energia forrás. • A laktózinducer (efektor molekula), három fehérje termelését az 1000-szeresére növeli: • -galaktozidáz (lacZ) • A laktózt glükózra + galaktózra hidrolizálja. • A laktózt allolaktózzá alakítja, ez regulálja alac operont. • Laktóz permeáz (lacY) • Laktóz transzport a citoplazma membránon. • Transzacetiláz (lacA) • A többi szacharidot acetilezi.

  16. Az E. coli lac operon: Francois Jacob és Jacques Monod • Két különböző mutáció típust vizsgáltak a lac operonban: • Mutációk a fehérje-kódoló génszekvenciákban. • Mutációk a szabályozó szekvenciákban.

  17. Fehérje kódoló gének szekvenciáiban mutánsokkal térképezték a géneket: • lacZ (-galaktozidáz)knock-out mutánsok (funkció vesztés) gátolják alaktóz permeáz (lacY) és a transzacetiláz (lacA) funkciókat. • lacY (laktóz permeáz) knock-out mutánsok gátolják a transzacetiláz (lacA) funkciót, de nincsenek hatással a -galaktozidázra (lacZ). • lacA (transzacetiláz) knock-out mutánsok sem a-galaktozidázt (lacZ) sem pedig a laktóz permeázt (lacY) nem befolyásolják. Következtetés: a 3 lac operon gén a következő sorrendben kapcsolt: • lacZ • lacY • lacA

  18. Alac operon transzlációja vad típusúés mutánsE. coli-ban.

  19. 2. A gén-megnyilvánulást befolyásoló mutációk a regulátor szekvenciákban: Jacob és Monod olyan mutánsokat is vizsgált, amelyek annak függvényében termelték a lac operon fehérjéit, hogy jelen volt-e az inducer laktóz: 2 típusú upstream lac regulátor mutánst jósoltak meg: • Mutációk alac operátorban (lacO) • Mutációk a lac represszorban (lacI)

  20. Mutációk a lac operátorban (lacO): Parciális diploidE. colitörzseket használtak:lac operon gének normális promóterrel a plazmidon (F’) . • Plazmid F’ lacO+ lacZ- lacY+ permeáz (csak laktózzal) • Kromoszóma C lacOc lacZ+ lacY- -galaktozidáz (laktóz nélkül is) (folyamatosan megnyilvánul, konstitutív) Következtetések: • AlacOalacZés alacYelőtt helyezkedik el és az utána következő fehérjék termelését befolyásolja ugyanazon a molekulán. • AlacOegy szabályozó DNS szekvencia; nincs diffúzóra képes géntermék. • Ha lenne diffúzióra képes géntermék, akkor laktóz nélkül is termelődne permeáz.

  21. Mutációk a lac represszorban (lacI): Szintén parciális diploidE. coli F’ törzsekkel;lac operon gének normális promóterrelés normális operátorral. F’ lac I+lacO+ lacZ- lacY+ C lacI- lacO+ lacZ+ lacY- • Laktóz nélkül, nincs-galaktozidázés permeáztermelés. • Laktózzal (inducer), -galaktozidáz és permeáz szintetizálódnak. Következtetés: • lacI+represszor fehérjét kódol (diffúzióra képes termék). • Laktóz nélkül a represszor fehérje kötődik az operátorhoz és gátolja a downstream fehérjék termelődését. • Laktóz jelenlétében a represszor fehérjét gátolja az allolaktóz és a fehérjék termelődnek.

  22. Mutáció lehet a promóterben is (Plac): • Gátlódhat az RNS polimeráz kötődése és nincs fehérje szintézis a struktúrgénekről, ha van laktóz, ha nincs. • Egyetlen mutáció mindhárom fehérje génjét befolyásolja,lacZ, lacY, éslacA.

  23. Alac operon szerveződése a vad típusú E. coli-ban. A szabályozó elemek és a gének sorrendje: lacI: promóter-lacI-terminátor operon: promóter-operátor-lacZ-lacY-lacA-terminátor

  24. AzE. colilac operon funkcionális állapota laktóz nélkül:

  25. AzE. colilac operon funkcionális állapota laktózon növesztve:

  26. Alac represszor modellje tetramer (4 polipetid) fehérje.

  27. A Jacob-Monod féleE. colilac operon modell: • Az operon egy génklaszter; a gének megnyilvánulásást opero-represszor kölcsönhatás szabályozza. • Alac I génnek van saját gyenge promótere és terminátora;lacI represszor fehérje mindig van kis mennyiségben. • A represszor fehérje tetramer (4 polipeptid). • A represszor kötődik az operátorhoz (lacO) és akadályozza az RNS polimerázt a transzkripció iniciációjában. • A kötődés reverzibilis, így mindig van kevésLacZ, LacY, ésLacA fehérje. • Amint nagy mennyiségű laktóz kerül a tápoldatba a lac operon azonnal bekapcsol. • A laktózon növekvő vad típusúE. coli-ban a -galaktozidáz a laktózt átalakítja allolaktózzá. • Az allolaktóz kapcsolódik a represszorhoz, ezért a represszor fehérje alakja megváltozik és nem tud kötődni az operátorhoz. • Az allolaktóz indukálja a lac operon expresszióját.

  28. Az RNS polimeráz egyetlen poligénes mRNS szintézisét iniciálja, a lacZ, lacY, éslacAgének mRNS-ét. • mRNSegyetlen molekulaként transzálódik riboszóma füzérrel. • A lac operon úgynevezettnegatív kontroll alatt áll (a lacIblokkolja az RNS polimerázt, ha nincs indukáló ágens) • Különböző típusú mutációk lehetnek alacO, alacI, ésa promóter régiókban: lacO -megváltozik a represszor kötőhelye (represszor nem tud kötődni) -állandó, konstitutív exszpresszió lacI -a represszor konformáció változik meg (nem tud kötődni az operátorhoz) -konstitutív -szuper-represszorköti az operátort, de az allolaktózt nem -a laktóz nem tudja indukálni az operont, nincs expresszió promóter -megváltozik affinitása az RNS polimerázhoz -növeli, vagy csökkenti a transzkripció mértékét

  29. Alac operon pozitív szabályozás alatt is áll: • Pozitív a lac operon szabályozása, ha azE. coli egyedüli C-forrása a laktóz (de nem, ha glükóz is van a tápoldatban). • A katabolit aktívátor fehérjéhez (catabolite activator protein) (CAP)kötődik a cAMP, aktíválódik, és kapcsolódik a promóter előtti CAP felismerő helyhez (cAMP koncentráció nagyon kicsi glükóz jelenlétében). • CAP megváltoztatja a DNS konformációját, megkönnyítve az RNS polimeráz kötődését és a transzkripciót. • Ha glükóz és laktóz egyszerre vannak jelen, a glükózt hasznosítja először a kevés cAMP miatt nem aktíválódik elegendő CAP. (diauxiás növekedés) • Ha feleslegben adunk cAMP-ot, akkor lesz transzkripció a lac operonról, még glükóz jelenlétében is. • A LacI lokális, helyi szabályozó. • A CAP globális, máshol is ható szabályozó.

  30. Alac operon pozitív szabályozása CAP-val

  31. Alac operon szekvencia volt az első jól jellemzett génszabályozási modell : • A lac operon promóter -84 bp-ra kezdődik, közvetlenül alacI stop kodon utánés -8 bp-ravégződik a transzkripciós starthelytől. • CAP-cAMP kötőhelyek -54 →-58 és -65 → -69. • RNS polimeráz kötőhely -47 → -8. • Operátor a promóter mellett -3 → +21. • mRNS transzkriptum +1 bp-nál kezdődik, az operátorban. • A -galaktozidáz génnek a start kodon előtt van egy vezető szekvenciája (riboszóma kötőhely/Shine-Delgarno szekvencia) • A -galaktozidáz start kodonodon (AUG) +39 → +41

  32. Lac operon szabályozó szekvenciái

  33. AzE. colitriptofán operon: • Ha van aminosav a tápoldatban, akkor „importálja” az aminosavakat, mielőtt szintetizálna. • Az aminosav szintézis gének represszáltak, represszálható operonok. • Ha nincs aminosav a táptalajban, a gének „bekapcsolnak” (megnyilvánulnak) és lesz aminosav szintézis. • AzE. colitriptofán operonja az egyik legjobban tanulmányozott represszálható operon.

  34. AzE. coli Trp operon; (Charles Yanofsky és mtsai.): • A Trp operon ~7kb méretű és 5, a triptofán szintézishez szükséges génterméket kódol , trpA-E. • A promóter és az operátor atrpEelőtt van. • A vezető régió (trpL) atrpA-Estruktúrgének és az operátor között helyezkedik el. • AtrpL-ben van egy attenuátor régió (att). • TrpR (represszor fehérje gén) a promóter előtt van.

  35. AzE. coli Trp operon szerveződése:

  36. Atrp operon szabályozása: Atrp operont két mechanizmus szabályozza: Represszor/operátor kölcsönhatás A megkezdett transzkripció attenuációja (a transzkripció megakad)

  37. 1. Represszor/operátor kölcsönhatás • Ha van triptofán, akkor kötődik a trpR géntermékéhezt. • trpRfehérje kapcsolódik atrp operátorhoz és megakadályozza a transzkripciót. • A represszió ~70-edére csökkenti a trp operon transzkripciójának mértékét.

  38. 2. A megkezdett transzkriptum terminációja • A transzkripciótattenuáció is szabályozza, egy rövid, nem komplett fehérje transzlálódik. • Ha a sejtek „éheznek” triptofánra, akkor a trp gének maximálisan kifejeződnek. • Kevésbé súlyos éhezés esetén, csak a maximálisnál kisebb mértékben nyilvánulnak meg. • Az attenuáció a transzkripció mértékét 8-10-szeres faktorral szabályozza; a repressziós mechanizmussal kombinálódva 560-700- szoros mértékben csökkentheti.

  39. Az attenuáció molekuláris modellje: • A vezető régió (trpL) az operator és atrpE szekvenciák között van. • E vezető szekvenciában van az attenuációs régió (att). • Azattszekvenciában start kodon, 2 Trp kodon, egy stop kodon, és négy olyan szekvencia régió, amelyek három alternatív másodlagos szerkezet kialakítására képesek. • Másoglagos szerkezetSzignál • H-híd kötések 1-2 régió szünet • H-híd kötések2-3 régióantitermináció • H-híd kötések3-4 régiótermináció

  40. A vezető /attenuátor trp operon szekvencia:

  41. Emlékezzünk arra, hogy prokariótákban a transzkripció és a transzláció egyszerre, egy helyen. • Az mRNS 1 és 2 régiói között kialakuló H-híd kötések (hajtű, stem loop) megakasztja az RNS polimerázt, amint ez a rész szintetizálódott. • A szünet éppen elég hosszú ahhoz, hogy a riboszóma kapcsolódjon az mRNS-hez és elkezdje a transzlációt közvetlenül az RNS polimeráz mögött.

  42. A riboszóma helyzetének fontos szerepe van az attenuációban: Ha a Trpkevés, vagy nincs utánpótlás (és szükséges): • Trp-tRNS-eknincsenek, a riboszóma megáll a Trpkodonoknálés lefedi az 1-es attenuátor régiót. • Az 1-es és 2-es régiók között nem tud kialakulni a hajtű szerkezet, ehelyett a 2-es régió a 3-assal alakít ki hajtűt, amint az elkészült. • A 3-as régió (most a 2-essel párban) a 4-essel nem tud kapcsolódni a szintézis után. • Az RNS polimeráz folytathatja a 4-es régió után a teljes trp mRNS szintézisét.

  43. A riboszóma helyzete fontos az attenuációnál: Ha a Trp elegendő (és nem szükséges): • A riboszóma nem áll meg a Trpkodonoknálés folytatja a vezető polipeptid szintézisét, befejezve a 2-es régiónál. • A 2-es és a 3-as régiók nem képezhetnek hajtűt, ezért az a 3-as és a 4-es régió között alakul ki. • A 3-as és a 4-es régió közötti hajtű az „attenuátor” szekvencia és terminációs szignálként szolgál. • A transzkripció azelőtt fejeződik be, hogy a triptofán struktúrgéneket elérte volna az RNS polimeráz.

  44. Az attenuációs modell aTrpéheztetett sejtekben.

  45. Attenuáció modellje elegendőTrpjelenlétében.

  46. Phe, His, Leu, Thr, ésIle operonok feltételezett attenuátorainak aminosav szekvenciáiE. coli-ban.

  47. E. coli RNS ploimeráz σ kaszkád

  48. Osztódási ciklus Spórázás-csírázás ciklus ? Metabolit és környezeti jelek ABacillus subtiliséletciklusa • B. subtilisspórázik, ha a környezeti feltételek kedvezőtlenné válnak

  49. Különböző típusú kölcsönhatások : gének, fehérjék és kis molekulák között a B. subtilis spórázásának szabályozásánál AbrB SinR~SinI Spo0A~P aktiváljasin operont SinR H A   SinI - AbrB represszáljasin operont SinI inaktiválja SinR-t sinI sinR + Spo0A˜P sin operon Szabályozási kölcsönhatások

More Related