Dr. Julio César Marín Leal ( Profesor )

1. UNIVERSIDAD DEL ZULIA FACULTAD DE INGENIERÍA DOCTORADO EN INGENIERÍA AMBIENTAL TÓPICO ESPECIAL DOCTORAL: ECOTOXICOLOGÍA ACUÁTICA Tema 7. Biomarcadores de contaminación acuática Dr. Julio César Marín Leal (Profesor) Maracaibo, 2013

2. Conceptos básicos. Biomarcador El término “biomarcador" ha ido ganando aceptación en los últimos años, aunque con cierta falta de coherencia en la definición. Aquí, definimos biomarcadores como “cualquier respuesta biológica a una sustancia química del ambiente a nivel individual que implica una desviación del estado normal“ (Walker y col., 2004).

3. Conceptos básicos. Biomarcador Es un parámetro que puede utilizarse para identificar un efecto tóxico en un organismo, y puede permitir la extrapolación interespecies o bien es un indicador que señala un acontecimiento o una situación en una muestra o sistema biológico y proporciona una medida de la exposición, el efecto o la susceptibilidad.

4. Conceptos básicos. Biomarcador Las mediciones bioquímicas, fisiológicas, histológicas, morfológicas y de comportamiento han de ser consideradas como biomarcadores. Algunos ejemplos de biomarcadores en diferentes niveles de organización se dan en la Tabla 1.

5. Conceptos básicos. Biomarcador TABLA 1. biomarcadores en diferentes niveles de la organización.

6. Figura 1. Biomarcadores de daño temprano en tres niveles tróficos

7. Conceptos básicos. Biomarcadores de contaminación Antes de que se produzca la muerte o la enfermedad, tanto organismos como poblaciones responden al estrés cambiando diferentes parámetros - biomarcadores a nivel molecular, histológico, inmunológico y biomarcadores fisiológicos a nivel de organismo, población o ecosistema (Livingstone, 1993; López-Barea, 1994).

8. Conceptos básicos. Biomarcadores de contaminación En cualquier rama de la toxicología es importante la capacidad de medir la exposición a un agente tóxico, la extensión de cualquier respuesta tóxica y también predecir la respuesta probable. Las herramientas que permiten que esto se lleve a cabo se llaman biomarcadores (Timbrell, 1998).

9. Conceptos básicos. Biomarcadores de contaminación Estos biomarcadores, permiten evaluar los efectos del estrés subletal sobre los organismos expuestos a sustancias contaminantes, reflejando el estado de estos organismos a nivel molecular o celular como respuesta a dicho estrés. Poseen una alta relevancia en la toxicología y son indicadores prematuros de las alteraciones ambientales antes de que se produzca en el ecosistema un daño irreversible (Timbrell y Draper, 1994).

10. Conceptos básicos. Biomarcadores de contaminación Los biomarcadores a niveles de población, comunidad o ecosistema, responden más lentamente que los biomarcadores moleculares o celulares y, a menudo, detectan daños irreversibles, aunque tienen un significado ecológico más relevante. Se requiere un trabajo adicional para demostrar que las respuestas en el laboratorio a los diferentes contaminantes son comparables con los datos de campo. Previamente al uso de los biomarcadores para la evaluación de la contaminación, se debe establecer el intervalo de respuesta de los organismos a variables naturales como calor, O2, tensión, parásitos, infecciones, estrés reproductivo, etc. (Livingstone, 1993).

11. Conceptos básicos. La relación entre biomarcadores y bioindicadores en cuanto a su especificidad y relevancia ecológica se muestra esquemáticamente en la Figura 1.

12. Clasificación de los biomarcadores Se han propuesto un número de clasificaciones de biomarcadores. La más utilizada es la división en biomarcadores de exposición, biomarcadores de efecto y biomarcadores de predicción de riesgo . • Los biomarcadores de exposición son los que indican la exposición del organismo a los productos químicos, pero no dan información del grado de efecto adverso que provoca este cambio. • Los biomarcadores de "efecto", o más correctamente “efecto tóxico”(debido a todos los biomarcadores, por definición, muestran un efecto), son aquellos que demuestran un efecto adverso en el organismo.

13. Clasificación de los biomarcadores • Biomarcadores de predicción de riesgos: Losque predicen la posibilidad de una alteración grave a nivel de población, comunidad o ecosistema. La estacionalidad de los procesos fisiológicos (reproducción, desarrollo, etc.) y factores ambientales (nutrientes, temperatura, etc.) condiciona sus respuestas (Sheehan and Power, 1999). Para minimizarlo y facilitar la interpretación de los datos, los programas de biomonitorización deben realizarse en distintas épocas del año y/o usar organismos control o referencia en cada estación.

14. Clasificación de los biomarcadores Dentro de esta clasificación de biomarcadores de contaminación es posible realizar una subdivisión teniendo en cuenta la información específica como parámetros de evaluación de contaminación que son. A continuación se muestran diferentes tipos de biomarcadores según la clasificación realizada por van der Oosty col. (2003).

15. Clasificación de los biomarcadores De esta manera se pueden clasificar en: 1. Enzimas de biotransformación. 2. Parámetros de estrés oxidativos 3. Productos de biotransformación 4. Proteínas de estrés metalotioneínas y resistencia multixenobiótica 5. Parámetros hematológicos 6. Parámetros reproductivos y endocrinos 7. Parámetros genotóxicos 8. Parámetros fisiológicos y morfológicos

16. 1. Enzimas de biotransformación. Generalmente, los biomarcadores de efecto más sensibles son las alteraciones a nivel (y actividades) de enzimas de biotransformación. La inducción enzimática constituye un aumento en la cantidad o la actividad de estos enzimas, o ambos. Por el contrario, la inhibición enzimática se produce en el momento en el que se bloquea la actividad enzimática, posiblemente debida a una unión fuerte o a la formación de complejos entre enzima e inhibidores. En la biotransformación de compuestos xenobióticos se pueden distinguir dos tipos principales de enzimas: los enzimas de fase I y los enzimas de fase II y cofactores.

17. 2. Parámetros de estrés oxidativo. Muchos contaminantes ambientales (o sus metabolitos) han revelado la producción de efectos tóxicos relacionados con el estrés oxidativo (Winston y Di Giulio, 1991). La toxicidad del oxígeno radica en los efectos adversos debidos a las especies reactivas del mismo, y también hace referencia a los intermediarios reactivos del oxígeno, radicales libres del oxígeno u oxiradicales. Son de interés particular los productos de reducción del oxígeno molecular que puede reaccionar con macromoléculas celulares, posiblemente relacionadas con la inactivación enzimática, la peroxidación lipídica (LPO), daño de DNA y, finalmente, la muerte celular (Winston y Di Giulio, 1991).

18. 3. Productos de biotransformación. Otro tipo de biomarcador es el aumento en los niveles de productos de biotransformación, como los niveles de metabolitos en los fluidos corporales o la cantidad de enlaces covalentes que se forman entre metabolitos de compuestos químicos biodegradables y macromoléculas celulares (proteínas, RNA, DNA) (Melancony col., 1992).

19. 4. Proteínas de estrés, metalotioneínas y resistencia multixenobiótica. Las proteínas de estrés comprenden un amplio grupo de proteínas involucradas en la protección y reparación de la célula contra el estrés y las condiciones dañinas (Sanders, 1993). Un grupo especial de proteínas de estrés son las metalotioneínas, que son inducidas por metales pesados esenciales y no esenciales (Viarengoy col., 2000), y las P - glycoproteínas, del mecanismo de resistencia multixenobiótica, que pueden ser inducidas o inhibidas por una amplia variedad de compuestos químicos (Bard, 2000).

20. 5. Parámetros hematológicos. Varios parámetros hematológicos pueden constituir biomarcadores potenciales. Así, se pueden considerar parámetros hematológicos los niveles de transaminasa, hemoglobina, hepatocitos, hormonas esteroideas específicas, proteínas, etc.

21. 6. Parámetros inmunológicos. El sistema inmune contiene un conjunto de células de rápida proliferación y diferenciación, cuya función está directamente relacionada con otros órganos y funciones.

22. 7. Parámetros reproductivos y endocrinos. El impacto de compuestos xenobióticos en la reproducción y en los efectos endocrinos ha generado un creciente interés en los últimos años. La regulación hormonal puede verse afectada como consecuencia de la exposición a contaminantes ambientales.

23. 8. Parámetros genotóxicos. La exposición de un organismo a compuestos químicos genotóxicos puede desencadenar una cascada de sucesos (Shugarty col., 1992): formación de alteraciones estructurales en el DNA, manifestación de daño de DNA y consecuente expresión en productos genéticos mutantes, y enfermedades (Por Ej. cáncer) dando lugar a daños de DNA. La detección y cuantificación de varios sucesos en la secuencia puede ser utilizada como biomarcador de exposición y efecto en organismos expuestos a sustancias genotóxicas en el ambiente.

24. 9. Parámetros fisiológicos y morfológicos. La determinación actual de los efectos adversos o de las consecuencias de estos efectos puede utilizarse también como biomarcador. La determinación de efectos adversos se puede realizar histopatológicamente, investigando lesiones, alteraciones o formación de tumores (neoplasmas en tejido).

25. Otros aspectos de los biomarcadores Los biomarcadores son parámetros cuya alteración indica la exposición de los bioindicadores a contaminantes, sus efectos biológicos o los riesgos para los ecosistemas. Los biomarcadores funcionan a distintos niveles: molecular, celular, histológico, organismo, población, de comunidad o ecosistema (Tabla 2). Los moleculares son alertas tempranas, pues se alteran antes que los ecosistemas sufran daños irreversibles. Aquellos a nivel de población, comunidad o ecosistema tienen mayor relevancia toxicológica, pero responden de forma más lenta (Livingstone, 1993; Peakall, 1994; Lopez-Barea, 1995; Timbrell, 2001).

26. Tabla 2. Biomarcadores, tiempo y tipo de respuesta, nivel de organización biológica al que pertenecen, y sus niveles de detección.

27. Tabla 2. Biomarcadores, tiempo y tipo de respuesta, nivel de organización biológica al que pertenecen, y sus niveles de detección. (Continuación).

28. Tabla 2. Biomarcadores, tiempo y tipo de respuesta, nivel de organización biológica al que pertenecen, y sus niveles de detección. (Continuación).

29. Especificidad de los biomarcadores Los biomarcadores van desde aquellos que son altamente específicos; como una enzima de la vía de hemo ácido aminolevulínicodeshidratasa (ALAD), que es inhibida sólo por el plomo, a los que no son específicos, mientras que los efectos sobre el sistema inmune puede ser causada por una amplia variedad de contaminantes. Un listado de los biomarcadores en el orden de su grado de especificidad está dada en la Tabla 3.

30. Tabla 3. Algunos biomarcadores enumerados en orden decreciente de especificidad de efecto adverso

31. Tabla 3. Algunos biomarcadores enumerados en orden decreciente de especificidad de efecto adverso

32. Especificidad de los biomarcadores A mayor nivel de organización la sensibilidad, especificidad y precisión de las respuestas suelen disminuir, mientras que la relevancia ecológica aumenta. La especificidad de un biomarcadorse ha referido a diversos grupos de contaminantes, tales como metales pesados y ciertos compuestos orgánicos, desconociéndose para otros contaminantes.

33. Relación entre los biomarcadores y los efectos observados.

34. Relación entre los biomarcadores y los efectos observados.

35. Biomarcadores en vertebrados Las características sexuales secundarias y gonadales fueron propuestas como posibles biomarcadores de exposición a partir de los efectos provocados por los perturbadores endocrinos. El estudio de estos biomarcadores es de radical interés debido a las potenciales consecuencias que una perturbación puede ocasionar sobre la reproducción y conservación de las especies. En peces, anfibios y reptiles se observar con alteraciones que incluyen el tamaño, forma e histoarquitectura de órganos sexuales, como lo demuestran los estudios en tortugas (de Solla y col., 1998), peces (Feist y col., 2005; Tofty col., 2003), aligatores y yacarés (Guillettey col., 1995a; Stoker y col., 2003), masculinización de hembras (Sone y col., 2005), feminización de machos (Sharpe, 2006), y hermafroditismo, en sapos (Hayes y col., 2003).

36. Biomarcadores en peces • Cambios producidos en las branquias de peces de diferentes ambientes acuáticos. • Aumento en la actividad de Acetilcolinesterasa (AChE) y depresión en la actividad natatoria. • Biomarcadores mitocondriales de estrés oxidativo y lipotoxicidad La respuesta individual de un solo biomarcador no se puede considerar suficiente para brindar diagnosis completa de los efectos de la polución. Sin embargo, el empleo de una batería de biomarcadores en forma conjunta con otras mediciones químicas y biológicas permitiría alcanzar dicho objetivo (Cajaraville y col., 2000).

37. Biomarcadores en peces

38. Biomarcadores en invertebrados Una variedad de biomarcadores han sido usados en invertebrados marinos, especialmente organismos bentónicos, preferiblemente aquellos que se alimentan mediante la filtración de partículas suspendidas en la columna del agua, como es el caso de los bivalvos. Debido a la importancia que tienen los bivalvos en los ecosistemas marinos y su capacidad de respuestas de defensa para evitar daños por xenobióticos, éstos han sido sugeridos como eficientes modelos biológicos para estudios de impacto ambiental inducido por contaminantes (Dyrynda Y col., 2000).

39. Biomarcadores en invertebrados La peroxidaciónlípidica (LPO) es un mecanismo de daño celular tanto en animales como vegetales, siendo por ello utilizado en ocasiones como indicador del estrés oxidativo y biomarcador de contaminación ambiental.

40. Biomarcadores en plantas El uso de biomarcadores en mamíferos marinos está en sus inicios y todavía se necesita un considerable esfuerzo investigador para poder validar su aplicabilidad.

41. Biomarcadores en plantas Los principales biomarcadores reseñados en plantas como respuesta a la exposición a metales pesados son aumento en la peroxidación lipídica, variaciones en la relación clorofila/carotenoides, aumento en la concentración de ácido jasmónico, nicotianamina, glutatión (GSH) y tioles, aparición de péptidos quelantes y fitoquelatinas, y aumento en la actividad o inhibición de las enzimas antioxidantes (Weber y col., 2004; Smeets y col., 2005; De la Rosa y col., 2005; Mendoza y Moreno, 2006).

42. Referencias bibliográficas • Cajaraville.M., Bebianno. M., Blasco. J., Porte. C., Sarasquete, C. and Viarengo.A. (2000). The use of biomarkerstoassesstheimpact of pollution in coastalenvironments of theIberianPeninsula: a practicalapproach. Sci. Total Environ., 247, 295-311. http://dx.doi.org/10.1016/S0048-9697(99)00499-4 • De la Rosa. G., Martínez-Martínez. A., Pelayo. H., Peralta-Videa .J., Sánchez-Salcido. B. y Gardea-Torresdey. J. (2005) Production of low-molecular weightthiols as a response tocadmiumuptakebytumbleweed(Salsolakali). PlantPhysiol. Biochem. 43, 491-498. • Dyrynda. E., Law.,R., Dyrynda. P., Kelly. C., Pipe. R. y Ratcliffe. N. (2000). Changes in immuneparameter of natural musselMytilusedulispopulationsfollowing a majoroilspill(‛sea Empress’, Wales, UK). Mar. Ecol. Prog. Ser., 200: 155-170. • Livingstone. D. (1993). Biotechnology and pollution monitoring: use of molecular biomarkers in the aquatic environment. Journal of Chemistry. Technology and Biotechnology . 57, 195-211. • López-Barea. J. (1995). Biomarkers in ecotoxicology: anoverview. En G.H. Degen et al., (Eds.), Toxicologyin transition, 1994 EUROTOX proceedings, Springer, Berlin. 57- 79.

43. Referencias bibliográficas • Mendoza DG, Moreno R (2006) Control of glutathioneand phytochelatinsynthesisundercadmiumstress. Pathwaymodelingforplants. J. Theor. Biol. 238, 919-936. • Peakall. D. (1994). Biomarkers: the way forward in environmental assessment. ToxicolEcotoxicolNews . 1, 55 - 60. • Sheehan. D. y Power. A. (1999). Effects of seasonality on xenobiotic and antioxidant defencemechanismsof bivalvemolluscs. CompBiochemPhysiol C PharmacolToxicolEndocrinol. 123, 193-199. • Smeets. K., Cuypers. A., Lambrechts. A., Semane. B., Hoet. P., Laere. A. y Vangronsveld. J. (2005) Inductionof oxidative stress and antioxidativemechanismsin PhaseolusvulgarisafterCd application. PlantPhysiol. Biochem,43, 437-444. • Timbrell.J. (1998). Biomarkers of toxicology. Toxicology, 129: 1-12 van den Berg, M.G., 1988. Electroanalyticalchemistry of sea-water. En: Chemical Oceanography. 9, 197-245.

44. Referencias bibliográficas • Timbrell. J., Draper. R. & Water. C. (1994). Biomrkers in ecotoxicology: new uses for some old molecules?. Toxicolology and Ecotoxicology News. 1,4-14.

45. Gracias por su atención