Transformaci ó n Bacteriana Original de Essy Levy, M.S. y Julie Mathern

1. Alianza para el Aprendizaje de Ciencias y Matemáticas (AlACiMa) Transformación Bacteriana Original de Essy Levy, M.S. y Julie Mathern

2. Temas Cubiertos • Introducción • Transformación de bacteria con el plásmido de pGLO • Inducción de la expresión de GFP con arabinosa y la subsecuente purificación de la proteína

3. pGLO™& GFP

4. Dogma Central de la Biología Molecular ADN ARN Proteína Característica

5. El ciclo celular

6. De ADN a proteína

7. Kit de Transformación de Bacteria con plásmido pGLO™

8. Procedimiento deTransformación Day 2 Day 1

9. ¿Qué es una Transformación? Alteracion de una Bacteria como resultado de la incorporación de ADN exógeno (que viene de afuera de la célula). Frecuentemente, el ADN es circular y llamado plásmido. GFP bacteria b-Lactamasa Confiere Resistencia al Antibiótico Ampicilina. plásmidos

10. Métodos de Transformación • Electroporación • Un choque eléctrico resulta en que la célula sea permeable al plásmido ADN • Cloruro de Calcio y Choque Térmico • Las células químicamente competentes absorben el ADN después del choque térmico

11. ¿Qué es un plásmido? Un pedazo circular de ADN de doble cadena, que se replica autónomamente. Fue evolucionado originalmente en bacterias. Puede expresar resistencia a un antibiótico o puede ser modificado para expresar una proteína de interés.

12. Plásmido pGLO • Beta-Lactamasa Confiere resistencia al antibiótico ampicilina. • Proteína Verde Fluorescente (“Green Fluorescent Protein, GFP”) Aequorea victoria, gen de medusa • araC: Regulador Regula la transcripción de GFP

13. Transformación con pGLO Pared celular GFP Bacteria Cromosoma Bacteriano (ADN) Beta-Lactamasa (resistencia a ampicilina) Plásmidos de pGLO

14. Proceso de Transformacion • Suspender las colonias en la Solución de Transformación. • Añadir el plásmido pGLO ADN. • Incubar los tubos en hielo por 10 minutos. • Choque térmico a 42°C por exactamente 50 segundos, y luego colocar en hielo por 2 minutos. • Añadir el caldo nutriente LB e incubar a temperatura ambiente. • Esparcir 100 mL de la suspensión por la superficie de las placas de agar.

15. ¿Que es el caldo nutriente de LB? • Caldo Luria-Bertani (LB) • Un medio que contiene los nutrientes para el crecimiento bacteriano y la expresión de los genes de interés. • carbohidratos • aminoácidos • nucleótidos • sales • vitaminas

16. Importancia de cada paso de la transformación O Ca++ O P O Base • La solución de transformación contiene CaCI2. La carga positiva del los iones de Ca2+ neutralizan la carga negativa de los fosfatos del ADN. O O CH2 Azúcar O Ca++ O O P Base O O CH2 Azúcar OH

17. Importancia de cada paso de la transformación Pared Celular GFP 2. Incubación en hielo -disminuye la fluidez de la membrana celular. 3. Choque térmico -incrementa la permeabilidad de la membrana celular. 4. La recuperación con LB permite la expresión de la beta-lactamasa. Beta-Lactamasa (resistencia a ampicilina)

18. ¿Qué observó en las placas de agar? Crecimiento de colonias que no brillan. Crecimiento de colonias que sí brillan. Ningún Crecimiento de Bacterias. Crecimiento en área completa.

19. De ADN a proteína

20. Relación de RNA con las cadenas del DNA

23. Unidad transcripcional

24. Regulación de Transcripción • Operón de Arabinosa • Plásmidos de pGLO

25. araC araC araC araC Regulación de la expresión del gen Operón GFP Operón ara araC Gen de GFP araC B A D Efector (Arabinosa) Efector (Arabinosa) Gen de GFP araC B A D araC ARN Polimerasa ARN Polimerasa B A D Gen de GFP

26. ¿Cómo podemos expresar genes eucariotas en células procariotas?

28. Preparación de cDNA