Croissance industrielle des microorganismes
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. Raisons : Obtention d'une biomasse servant - soit d'aliment (levures comme compl

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Croissance industrielle des microorganismes

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Presentation Transcript



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Raisons :

Obtention dune biomasse servant

- soit daliment (levures comme complment nutritionnel)

- soit la fabrication daliment (levures pour la fabrication de pain, de bire, de brioches, de vin, moisissures pour fabrication de fromages, sak, bactries pour fabrication de yaourt, de choucroute.)

Synthse de molcules dintrt alimentaire, mdical ou industriel

acide citrique, pnicilline, cyclosporine..


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Plan

1- Les diverses techniques de culture

2- Caractristiques des souches utilises

3- Des exemples de cultures industrielles



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Deux grandes techniques de culture :

- Culture en discontinu = culture en batch

- Culture en continu = culture en milieu renouvel

Remarque : existence dun autre type de culture avec immobilisation des microorganismes




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1-1-1- Matriel de culture : bioracteur milieu non renouvel

  • 1- entre dair muni dun filtre (ou tuyau dchantillonnage)

  • 2- enveloppe de refroidissement

  • 3- entre deau de refroidissement

  • 4- moteur pour agitation

  • 5- manomtre (pour vrifier la pression interne)

  • 6- sortie de leau de refroidissement

  • 7- pales pour agitation

  • 8 tuyau de vidange



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Un bioracteur de laboratoire est une cuve accueillant de 1 5 L en gnral,

Un bioracteur de production industrielle est un cuve accueillant de quelques centaines de L plusieurs m3


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1-1-2- Principe de la culture en batch 5 L en gnral,

Culture en milieu clos dans une cuve de taille variable

- strilise

- remplie dun milieu de culture strile

- ensemence avec le microorganisme voulu

- permettant la croissance du microorganisme jusqu puisement des substances nutritives


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1-1-3- Caractristiques du milieu de culture 5 L en gnral,

  • Doit apporter au minimum une source d'nergie, de carbone, d'azote, dions minraux .

  • Est souvent riche en glucose, en peptones, en phosphates, en sulfates, en magnsium, en vitamines, et en oligolments.

  • Elments divers pouvant tre utiliss en industrie, seuls ou associs (voir cours sur la nutrition):

    • des mlasses, rsidus visqueux du raffinage de la betterave ou de la canne sucre, riches en glucides,

    • des liquides biologiques : du plasma, du lactosrum (protines)

    • des farines : vgtales (mas riche en amidon ; riz riche en amidon et en protines ; soja : riche en protines), de viande (protines, lipides), de poisson (mthionine, phosphore).


1 1 3 conditions d une bonne culture en bior acteur l.jpg
1-1-3- Conditions dune bonne culture en bioracteur 5 L en gnral,

Ncessit

- dune bonne agitation de la culture

  • d une rgulation de la temprature par refroidissement car les ractions mtaboliques lors de la croissance sont gnralement exothermiques

  • d une rgulation du pH car les ractions mtaboliques microbiennes peuvent acidifier ou alcaliniser le milieu

  • dune rgulation de la pression partielle en O2 par insufflation dair strile


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1-1-4- Avantages et inconvnients de la culture en batch 5 L en gnral,

Avantages

  • Pas de perte de microorganismes durant la culture

  • Possibilit de recueil des produits synthtiss tout moment, y compris durant la phase d e dclin

  • Peu de risques de contamination de la culture

Inconvnients

  • Existence dune phase de latence impropre la production

  • Pas de maintien de la phase exponentielle : donc biomasse et produits recueillis en quantits faibles : rendement limit

  • Difficult de striliser de grands volumes de milieu

  • Prparation longue



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1-2-1- Principe de la culture en milieu renouvel 5 L en gnral,

Culture du microorganisme en vase non clos de faon maintenir en permanence en phase exponentielle grce

- une addition rgulire de milieu neuf strile pour rapprovisionner en nutriments et maintenir le pH

- un soutirage dune quantit quivalente de milieu de culture permettant ainsi llimination rgulire des dchets.


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1-2-2- Matriels de culture 5 L en gnral,

  • Turbidostat

  • Chemostat ou bactogne



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1-2-2-1- Le turbidostat 5 L en gnral,

  • 1- Rservoir de milieu strile

  • 2 Valve de contrle du flux de milieu neuf

  • 3- sortie de milieu de culture

  • 4 cellule photolectrique relie la vanne dentre de milieu neuf ce qui permet via un systme lectronique une autorgulation du dbit en fonction de la concentration de la biomasse mesure en sortie.

  • 5- Source lumineuse

  • 6- Schma dun turbidostat.


1 2 2 1 principe de fonctionnement du turbidostat l.jpg
1-2-2- 1- Principe de fonctionnement du turbidostat 5 L en gnral,

  • Un turbidostat est un dispositif de culture en continu. La concentration du milieu de culture est maintenue constante par un contrle turbidimtrique.

  • Si le trouble tend trop augmenter il y a une augmentation dapport de milieu neuf qui dilue et ramne le trouble sa valeur initiale.

  • Si le trouble tend trop diminuer il y a diminution dapport de milieu neuf jusqu ce que la croissance ait permis de retrouver la valeur initiale


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1-2-2-2- Le chmostat 5 L en gnral,


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1-2-2-2- Le chmostat 5 L en gnral,


1 2 2 2 principe de fonctionnement du chemostat l.jpg
1-2-2- 2- Principe de fonctionnement du chemostat 5 L en gnral,

  • Introduction de milieu neuf strile dans la chambre de culture la mme vitesse que le milieu contenant les micro-organismes est limin (cest le volume de milieu frais qui chasse par trop plein le volume de culture microbienne).

  • Consquences :

    • stabilit de concentration en substances nutritives limitantes

    • microorganismes soumis une bonne aration, une vigoureuse agitation et ayant toujours leur disposition les lments nutritifs dont ils ont besoin

  • Multiplication maintenue exponentielle une vitesse spcifique de croissance rigoureusement contrle par lapport de milieu neuf.


1 2 3 avantages et inconv nients de la culture en continu l.jpg
1-2-3- Avantages et inconvnients de la culture en continu 5 L en gnral,

Avantages

  • Maintien de la phase exponentielle : rendement optimal

  • Strilisation facile du milieu

  • Rcupration des produits au fur et mesure de leur production

Inconvnients

  • Difficult du contrle du systme de rgulation

  • Difficult du maintien dune culture pure

  • Pas de possibilit de fabrication de produits librs uniquement durant la phase de dclin.




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Dcouverte de la pnicilline 5 L en gnral,

Dcouverte

Staphylococcus aureus

Penicillium


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Dcouverte de la pnicilline 5 L en gnral,

Staphylococcus aureus

Fleming recherchait des molcules inhibant les contaminants des cultures.

Un jour il ensemence une bote avec du S. aureus et oublie la boite sur la paillasse.

Quelques jours plus tard, il constate lapparition dun champignon (Penicillium notatum). Il remarque une zone dinhibition autour du Staphylococcus.

Il en dduit que le champignon produit une molcule inhibant ( distance) le Staphylocoque.

Penicillium


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Penicillium notatum 5 L en gnral, espce historique de la dcouverte de la pnicilline produisait de faible quantit de pnicilline.

Une souche de Penicillium chrysogenum fut isol en 1943 et utilise la place car davantage productrice

Cellule procaryote


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- Recherche de la meilleure souche productrice partir de constituants naturels (aliments, sols)

  • Slection, suite diverses mutations des clones ayant e meilleur rendement sans perte de leurs qualits

  • Amlioration des souches grce au progrs de la biologie molculaire

- Fusion de cellules

- Introduction dun DNA extrieur (ADN recombinant)



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Production industrielle ncessite une souche ayant les caractristiques suivantes :

  • Innocuit (non pathogne)

  • Bonne productivit (fort rendement = capacit synthtiser des quantits apprciables de produit attendu)

  • Stabilit gntique (ne perdant pas ses caractristiques aprs de nombreuses multiplications en bioracteur et lors de sa conservation)

  • Croissance rapide (de faon donner trs vite beaucoup de produit ou une biomasse importante)

  • Amliorabilit (idalement la souche doit pouvoir tre capable d'voluer sous la pression de l'industriel, dans le but d'amliorer ou de d'adapter la production)



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3-1- Intrt des cultures industrielles caractristiques suivantes :


Int r t dans le domaine l.jpg
Intrt dans le domaine caractristiques suivantes :

  • agroalimentaire

  • industriel autre


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3-1-1- Cultures industrielles en agroalimentaire caractristiques suivantes :

  • Obtention de levains servant la fabrication daliments

  • Obtention de levains servant daliments

  • Obtention de molcules participant la fabrication daliments


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3-1-1- 1- Obtention de levains servant la fabrication daliments

  • Saccharomyces cerevisiae pour la panification et loenologie

  • Saccharomyces cerevisiae et carlbergensis pour la fabrication de la bire

  • Lactobacillus pour les produits laitiers (yaourts) carns (saucissons) ou vgtaux (choucroute.)

  • Bacillus natto pour le natto

  • Penicillium roquefortii, Penicillium camembertii pour la fromagerie

  • Aspergillus flavus pour certains produits asiatiques (sak)


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Cas du vin : Levures oenologiques daliments

- Prsence naturelle sur la peau des raisins avec des espces variant selon lenvironnement et les cpages

- Peuvent galement tre ajoutes au mot

Saccharomyces : S. ellipsoideus, S. oviformis, S. cerevisiae

Torulospora rosei

Kloeckera apiculata

- Evolution de la flore au cours de la vinification :

S. ellipsoideus et S. oviformis sont les espces

les plus alcoolognes


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Principale raction de fermentation daliments:

Fructose et glucose thanol + CO2

100 250 g/L 60 170 g/L

(6 17%)

Ractions additionnelles donnent

des produits composants essentiels du bouquet du vin

- Sucres, acides organiques dont acide malique

glycrol, acides organiques (lactique, succinique), autres alcools, aldhydes

Puis combinaison de ces produits esters

Cellule procaryote


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Intrt de la fermentation malolactique : rduire lacidit du vin

Acide malique acide lactique

2 5g/L < 1g/L

COOH-CHOH-CH2-COOH COOH-CHOH-CH3

Raction assure par des bactries aprs la fermentation alcoolique:

- Lactobacillus

- Leuconostoc


Cas du cidre l.jpg
Cas du cidre lacidit du vin

- Jus de pomme cidre

- Mmes types de ractions que pour le vin

- Degr dalcool plus faible : 2 5%

- Principaux micro-organismes

  • fermentation alcoolique

    • Kloeckera de diverses espces

    • Saccharomyces uvarum et S. ellipsoideus

  • fermentation malolactique

    • Lactobacillus de diverses espces


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    Cas de la bire lacidit du vin

    - Grain dorge germs bire

    - Aromatisation par le houblon

    - 2 diffrences avec le vin et le cidre

    • amidon (sucre complexe) au lieu de sucres simples dans la matire premire

    • 2 tapes

      • hydrolyse enzymatique de lamidon jus sucr : le brassage

      • fermentation alcoolique du jus sucr

      • Ajout ncessaire des micro-organismes aprs le brassage

      • Saccharomyces cerevisiae : levure de bire

      • Saccharomyces carlsbergensis

        - Production trs importante de CO2 : mousse abondante

  • Processus comparable pour lobtention du sak : alcool de riz


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    Cas du pain lacidit du vin

    • Fermentation alcoolique galement

    • Levain ajout la pte pendant le ptrissage :

      - Saccharomyces cerevisiae

      • dautres levures ou des bactries peuvent tre ajoutes (pains spciaux)

    • Amidon sucres simples alcool + CO2

    • Leve de la pte grce au CO2

    • Modification galement du gluten et ainsi de latexture de la pte

    • Cuisson :

      • lalcool svapore

      • les bulles de CO2 persistent


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    Cas du yaourt lacidit du vin

    Les ractions chimiques : la fermentation homolactique lactique

    • Lactose du lait acide lactique

    • Aliment sucr aliment acide

    • De plus modification des protines (casine) par les mmes microorganismes

    • Aliment liquide aliment solide


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    Cas des fromages lacidit du vin

    Transformations complexes du lait de vache, de chvre, de brebis par les micro-organismes


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    Les 3 tapes de la fabrication des fromages lacidit du vin

    • Production du caill

      • Fermentation lactique par les bactries lactiques(cf yaourts)

        + prsure dorigine animale ou fungique

        Le lait coagule pH < 4,6 : casine gel + liquide (lactosrum = petit lait)

    • Egouttage du caill

      - Lent : fromages frais (ex: fr.blanc)

      fromages pte molle (ex: camembert, Munster, roquefort)

      - Acclr par pression ptes presses (ex: St Nectaire) ; fr pte ferme (ex: Cantal)

      - Acclr par pression + cuisson ptes fermes cuites (ex: gruyre, Comt)

    • Salage et affinage (dure 1 8 mois)

      • Ajout dune flore spcifique chaque fromage. Dveloppement de la flore.

        - Transformations microbiennes : Protolyse, lipolyse, mtabolisme des

        acides amins, des composs soufrsproduction darmes, de gaz,

        daldhydes, dalcools, dammoniac, diminution de lacidit


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    Exemples de micro-organismes participant la formation des fromages

    1- Des bactries

    Bactries lactiques : groupe prdominant: Streptococcus, Lactobacillus

    Leuconostoc, Lactococcus

    Propionibacterium (gruyres beaucoup de gaz)

    2- Des levures

    Saccharomyces lactis

    3- Des moisissures

    Penicillium : brie, camembert

    roquefort, bleus

    Geotrichum : camembert


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    Cas des produits vgtaux fromages

    Fabrication de choucroute

    • + NaCl 2 3% pour freiner le dveloppement des Gram

    • Fermentation lactique du chou par Leuconostoc et Lactobacillus (flore naturelle du chou)

    • pH<2

      Fabrication dolives, pickles (concombres, cornichons)

    • Augmentation progressive du salage jusqu 16% (saumure)

    • Fermentation lactique par Lactobacillus plantarum principalement

      Fabrication de sauce soja

    • Fermentation dun mlange sal de graines de soja et de bl par Aspergillus oryzae


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    Fabrication de la choucroute fromages

    Choucroute aprs le processus de fermentation

    Incision dans la fabrique

    Contrle qualit aprs le conditionnement


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    Cas des produits vgtaux (suite) fromages

    Fabrication de vinaigre

    Fermentation actique par

    Jus de raisin vin vinaigre

    Sucres thanol acide actique

    Bactries responsablers Acetobacter, Gluconobacter

    Fabrication de divers vgtaux ferments

    • Th noir (feuilles fermentes), caf (grains), cacao (fves), manioc, igname, mas, soja


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    Cas des produits animaux fromages

    Fabrication de saucissons, jambons fums

    Fermentation lactique par Pediococcus cerevisiae ; Lactobacillus plantarum

    Fabrication de prparations asiatiques de poisson

    Fermentations lactiques ou fermentations complexes par bactries et moisissures


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    Conclusion : intrt des fermentations lors de la fabrication dun aliment

    Fermentation lactique : acidification du milieu empchant ainsi la multiplication dautres microorganismes (conservateur).

    Autres fermentations : responsables des armes et des gots propres chaque aliment


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    3-1-1- 2- Obtention de levains servant daliments fabrication dun aliment

    • Levures


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    3-1-1- 3- Obtention de molcules utiles la fabrication daliments : quelques exemples

    Production

    - dacides organiques

    * acide citrique (conservateur)

    * acide lactique (conservateur) abondamment utilis en industrie alimentaire (laitire notamment) produit par Lactobacillus delbrueckii partir de lactosrum (plusieurs dizaines de milliers de tonnes par an)

    * acide glutamine (exhausteur de got)

    - denzymes (ex : chymosine (prsure), amylases, invertase, pectinase) par des moisissures ou des bactries

    - de dextrane, xanthane ou alginate, utiliss comme glifiants alimentaires produits partir de Leuconostoc, Xanthomonas par exemple cultivs sur amidons.


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    3-1-2- Cultures industrielles utiles pour un domaine autre quagroalimentaire

    Production

    • de biothanol par des levures (Saccharomyces et / ou des bactries) partir de mlasses de canne ou de betterave sucre ou de lactosrum utilis dans lindustrie chimique ou pour les voitures

    • de lipides utiles dans le domaine de la cosmtologie


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    3-1-2- Cultures industrielles utiles pour un domaine autre quagroalimentaire

    • Production

      • de protines dimportance mdicale (hormones, anticorps, molcules antitumorales, enzymes)

      • dantibiotiques

        • Soit par des moisissures (pnicilline par Penicillium, cphalosporines par Cephalosporium)

        • Soit par des bactries (streptomycine par Streptomyces..)

      • de molcules immunosuppressives



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    Molcules produites pouvant tre quagroalimentaire

    • Des mtabolites primaires

    • Des mtabolites secondaires

    • Des mtabolites issus dune bioconversion


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    3-2-1- Molcules produites : mtabolites primaires quagroalimentaire

    • Dfinition : molcules fabriques par le microorganisme pour ses besoins nutritifs et la croissance cellulaire.

    • Moment du recueil : priode de production = de la phase exponentielle de croissance.

    • Exemples :

      • enzymes, acides amins

      • Alcools, acides organiques.


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    3-2-2- Molcules produites : mtabolites secondaires quagroalimentaire

    • Dfinition : molcules fabriques aprs la phase de multiplication active, sans doute suite un stress microbien lors de la phase stationnaire.

    • Moment du recueil : fin de la croissance : phases exponentielle et de dclin.

    • Exemples : antibiotiques, protines.


    3 2 3 mol cules issus d une bioconversion d un substrat l.jpg
    3-2-3- Molcules issus dune bioconversion dun substrat

    • Dfinition dune bioconversion : transformation spcifique mineure dun compos mis dans le milieu de culture , non utilis normalement par le microorganisme

    • Exemples : hydroxylation de progestrone par diverses moisissures


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