Cristalografía de proteínas na universidade de Santiago de Compostela. Mark J. van Raaij

1. Cristalografía de proteínas na universidade de Santiago de Compostela. Mark J. van Raaij Departamento de Bioquímica e Bioloxía Molecular, facultade de Farmacia Unidade de Diffracción de Raios X, RIAIDT Universidade de Santiago de Compostela vanraaij@usc.es

2. por que determinar estructuras de proteínas? • - cristalización y cristalografía de macromoléculas • proteómica / genómica estructural • biología estructural de proteínas virales

3. por que determinar estructuras de proteínas? todavía no es posible predecir estructuras de proteínas la estructura de una proteína / macromolécula da pistas sobre su función, efecto de mutantes, etc. amino ácidos lejos en la secuencia primaria pueden estar muy cerca en 3D para descubrir nuevos plegamientos, mejorar la predicción de estructuras

4. como determinar estructuras de proteínas? • crio-microscopía electrónica • .cristales 2D: in membrano, proteínas de membrana • .partículas simples • - a resolución relativamente baja, apto para complejos grandes • espectroscopía NMR • - en solución • alta resolución • proteínas no muy grandes (< 30 kD) • difracción de fibras • - p. ej. proteínas del músculo • cristalografía de rayos X (neutrones)

5. cristalografía de rayos X • alta resolución, con datos (y fases) a ~ 3 Å de resolución o mejor se • pueden construir modelos atómicos • apto desde moléculas pequeñas (NaCl) hasta muy grandes (ribosomas) • proporcionan una imagen estática de la estructura, aunque reacciones • enzimáticas han sido estudiadas en cristales

6. pasos en la determinación de una estructura de una macromolécula • obtención de la macromolécula en escala de mg - expresión y purificación • cristalización - difusión de vapor, “micro-batch” • recogida de datos - ánodo rotante con detector, sincrotrón • determinación de fases - MR, MIR, SIRAS, MAD, SAD • análisis de la estructura • (verificación bioquímica de las conclusiones)

7. cristalización • muestra • - múltiples preparaciones de varios mg cada una a alta concentración (al menos 5 mg/ml, mejor 10-20 mg/ml o más) • alta pureza, tanto “química” como “conformacional” • estrategias de cristalización • en primera instancia probar ~100 condiciones muy diferentes • barrido de precipitantes vs pH (4-10) y temperatura (5 ºC y 20 ºC) • optimización de las condiciones más prometedoras (ajuste fino, aditivos) • métodos de cristalización • difusión de vapor, “micro-batch”, otros

8. métodos de cristalización difusión de vapor: gotas colgantes, sentadas o “sandwich”

9. métodos de cristalización “micro-batch”: placas Terazaki, “gotas flotantes”

10. métodos de cristalización micro-diálise: “botones”

11. cristalografía de macromoléculas datos “nativos”: hasta varios cientos de imágenes como esta si se conoce una estructura relacionada (> 30% de identidad en secuencia), resolución de la estructura por “Molecular Replacement” (reemplazamiento molecular) puede ser posible (MR)

12. si no se conoce una estructura homóloga: MIR: Multiple Isomorphous Replacement, utilizando varios “derivados” de átomos pesados - importancia del isomorfismo, encontrar derivados útiles puede ser complicado SIR: MIR pero con un solo derivado, normalmente aprovechando la señal anómala (Anomalous Signal, SIRAS) MAD: Multi-wavelength Anomalous Dispersion, utilizando un derivado o una proteína modificada con Se-Met (ácido nucleíco con Br) SAD: Single-wavelength Anomalous Dispersion

13. cuellos de botella típicos • la proteína no expresa • la proteína se expresa de forma insoluble • la proteína es difícil de purificar • la proteína no cristaliza • los cristales obtenidos no difractan rayos X • no se encuentran derivados útiles • duración típica de un proyecto: 3 meses - 3 años (o infinito)

14. proteómica / genómica estructural • determinación de todas las estructuras 3D de todas las proteínas de • un determinado organismo (Homo sapiens, Mycobacterium tuberculosis) • a diferencia de la biología estructural “tradicional”, determinación de • estructuras de proteínas antes de saber su función • clonaje, expresión, purificación y cristalización en paralela • - economía de escala • tasa de éxito individual limitado: 10-20%

16. proteómica / genómica estructural • determinación de todas las estructuras 3D de todas las proteínas de • un determinado organismo (Homo sapiens, Mycobacterium tuberculosis) • a diferencia de la biología estructural “tradicional”, determinación de • estructuras de proteínas antes de saber su función • clonaje, expresión, purificación y cristalización en paralela • - economía de escala • tasa de éxito individual limitado: 10-20% • spin-off: tecnología como vectores de expresión, automatización, • etc.

18. estructuras de fibras virales adenovirus reovirus aviar

19. morfología dominio de unión al virus dominio de unión al receptor - dominio central proporciona “alcance” - en general triméricas: - coiled coil - estructura beta proteínas estables (SDS, urea, temperatura, proteasas)

20. adenovirus • - icosaédrico • - caras : hexon, proteína trimérica • vertices: penton, base pentamérica, en el cual una fibra trimérica está • insertada • cabeza de la fibra une receptor, en humanos CAR (Coxsackievirus and • Adenovirus Receptor)

21. adenovirus aviar (CELO, FAV1) • no es un patógeno importante, pero uso potencial como vacuna • dos fibras en cada base del penton:. fibra larga, no-esencial, receptor CAR?. fibra corta, esencial para infección in vitro, receptor desconocido

22. estructura de la cabeza de la fibra larga resuelta por SIRAS con derivado de cloruro de metilmercurio y refinado con datos nativos a 1.6 Å de resolución en colaboración con Patrick Langlois, Ploufragan, Francia

23. cabeza de la fibra larga

24. .......---A---.......................----B-----..----C----.. AD2 ITIGNKNDDKLTLWT.TPDP.SPNCR.....IHSDNDCKFTLVLTKCGSQVLATVAALAV441 ...........|.........|.....................|...|..|..|...... LFH .......PEVATYHCGDNLLESYDIFASLPNTNAAK.VAAYCRLAAAGGVVSGTIQVTS. 633 ..................d..sp............k.........K.............v ..................---D----.....................-E--..F-..... AD2 SGDLSSM......TGTVASVSIFLRFDQNGVLM....ENSSLKKHYWNFRNGNSTNANPY 491 .....................|................|.|................... LFH ..YAGRWPKVGNSVTDGIKFAIVVS....PPMDKDPRSNLSQWLG.ATVF.......PAG 679 k..........................................k.y....n..st..... ......................................---G---..........---H- AD2 TNAVGFMPNLLAY..PKTQ.............SQTAKNNIVSQVYLH...GDKTKPMILT 533 .....|.||........|........................................|. LFH ATTALFSPNPYGSLNTITTLPSIASDWYVPESNLVT..YTKIHFKPTGSQQLQLASGELV 737 ...............P.p.......................................... ---..............---I----.........................--J----... AD2 ITLNGTSESTETSEVSTYSMSFTWSW....ESGKYT......TETFATNSYTFSYIAQE. 582 ........|....................................|.|....|.|..... LFH VAAA...KSPV.QTTKYELIYLGFTLKQNSSGTNFFDPNASSDLSFLTPPIPFTYLGYYQ 793 ............................................................ alineamiento de las secuencias de las cabezas de la fibra del adenovirus humano tipo 2 (AD2) y la fibra larga del adenovirus aviar basados en la estructura identifica pocos aminoácidos implicados en unión a CAR conservados

25. la fibra larga del adenovirus aviar probablemente no une CAR o lo hace de manera diferente que adenovirus humano rojo: cabeza de la fibra larga del adenovirus aviar amarillo: cabeza de la fibra del adenovirus humano tipo 12 azul: dominio 1 de CAR

26. reovirus aviar • - patógeno importante • genoma: 10 dsRNAs • 8 proteínas estructurales y 4 no-estructurales • cubierta interna: A, A, C • cubierta externa: C (fibra) • receptor desconocido A C C A en colaboración con Javier Benavente, USC

27. estructura del dominio • C-terminal de sigmaC, el • dominio de unión al receptor • de la fibra del reovirus aviar • resuelto por MAD con derivado de • cloruro de metilmercurio y refinado • con datos nativos a 2.1 Å de • resolución • lamina beta circular DABC-HEFG • con bucle DE largo • - dos repeticiones de espiral beta triple

28. aminoácidos conservados en todas las cepas del reovirus aviar en la superficie del trímero

29. futuro recursos • cristalización de macromoléculas - robot de cristalización • plataforma de expresión y purificación de proteínas para estudios estructurales • bacterias • (baculovirus, levadura, células de mamífero) • clonaje en vectores de expresión paralelo investigación • cristalografía de proteínas (no solo virales) • proyecto EU Artizymes “desarrollo de metalo-enzimas artificiales que contienen metales de transición” • proyecto EU BeNatural “nano-materiales biotecnológicos para investigación y aplicaciones”

30. agradécese a colaboración de: • Lois Hermo, Pablo Guardado, Patricia Ferraces, Antonio Llamas • grupo de Javier Benavente e José Martinez-Costas • Gavin Fox, ESRF Spanish beamline BM16 • unidade de difracción de raios X (RIAIDT) • financiamento: EU: proxectos Artizymes e BeNatural MEC: BFU2005-02974, BFU2005-24982-E (ESF: proxecto FolProCom, EuroSCOPE), HG2005-0012 (acción integrada Grecia) Xunta de Galicia: incentivo Artizymes, infraestructura (FPLC)