Progetto REPLAY 2008/2009

1. Progetto REPLAY 2008/2009 • 5^Bst – Genesis: • Mauro Constantinescu • Roberto Gambini • Gianluca Cannetti Trasformazione batterica

2. Schema generale: La trasformazione batterica è la prima fase del progetto REpLAY, e consiste nell’inserire all’interno di un ceppo di batteri E. Coli un plasmide (segmento di DNA circolare) contenente un gene per la resistenza ad un antibiotico, per fare in modo che resistano a loro volta a questo antibiotico. Tutto ciò viene verificato a livello fenotipico con la crescita dei batteri in un terreno solido contenente antibiotico, a livello molecolare con l’elettroforesi, dopo la seconda fase, la Miniprep di DNA. Questa fase si riassume nel seguente schema (l’elettroforesi, non facendo parte di questa fase, non vi è inserita):

7. 1. Preparazione all’inserimento del plasmide: Spostare le cellule competenti (E. Coli TOP 10 aliquotate) dal ghiaccio secco al ghiaccio e tenerle in ghiaccio per un paio di minuti prima dell’aggiunta del DNA.

11. 2. Inserimento del plasmide: Aggiungere 5μl di DNA plasmidico diluito 50 ng/l alle cellule. Incubare poi in ghiaccio per 30 minuti. Come mostra la foto a sinistra, l’inserimento del plasmide deve essere effettuata tenendo la soluzione in ghiaccio. Non in ghiaccio secco (-70°C) perché il plasmide verrebbe ucciso, ma neanche a temperatura ambiente, perché verrebbe denaturato.

12. Prova in negativo: La prova in negativo è una provetta all’interno del quale l’esperienza non avrà sicuramente successo: questo vuol dire che i batteri al suo interno non cresceranno a contatto con l’antibiotico. Per produrre questo risultato non devono essere inseriti plasmidi nella provetta con i batteri E. Coli, perché non deve avvenire la trasformazione. Questa prova è utile a verificare che i batteri iniziali non fossero già trasformati.

16. 3. Shock termico: innalzamento della temperatura: Lo shock termico è una rapida successione di un innalzamento ed un abbassamento di temperatura. Esso apre dei pori nelle pareti delle cellule per far entrare il plasmide. Le cellule competenti sono infatti molto sensibili agli sbalzi della temperatura. Per innalzare la temperatura dei batteri inserire le provette in un termo mixer per 40 secondi a 42°C. Questo affollamento di mani intorno al termo mixer indica che le provette vanno inserite contemporaneamente perché il tempo di incubazione sia uguale per tutti.

17. Shock termico: abbassamento della temperatura: Appena estratte dal termo mixer, incubare le cellule in ghiaccio per due minuti: i pori aperti con l’innalzamento della temperatura si richiudono.

18. 4. LB: incubazione in terreno di coltura: Aggiungere 250l di terreno di coltura LB fresco senza antibiotici ed incubare a 37°C per 42 minuti. I batteri si riprendono dallo shock termico ed eseguono un ciclo di riproduzione.

22. 5. LB + AMP: incubazione in terreno di coltura con antibiotico: Piastrare le cellule trasformate ed il controllo negativo su piastre con terreno di coltura LB con l’antibiotico Ampicillina. Aspettare una notte. Le cellule trasformate correttamente cresceranno sul terreno selettivo con l’antibiotico, perché hanno acquisito il plasmide contenente il gene per la resistenza all’Ampicillina.

23. Prova in negativo: La prova in negativo, se le cellule batteriche utilizzate inizialmente non erano già trasformate, non deve dare sviluppo di colonie: la piastra resterà vuota.

27. 6. Inoculi: Aspirare con una pipetta le colonie di batteri cresciuti durante la notte, introducendole in una provetta. Durante la notte i batteri trasformati correttamente si riproducono sul terreno nella piastra, sviluppando delle colonie (le bollicine nella foto).