1 / 82

Veselības zinātņu maģistra studiju programma uzturzinātnē Studiju kurss: Jaunā un ģenētiski modificētā pārtika

Veselības zinātņu maģistra studiju programma uzturzinātnē Studiju kurss: Jaunā un ģenētiski modificētā pārtika. ĢENĒTISKI MODIFICĒTĀ PĀRTIKA. INDRIĶIS MUIŽNIEKS, Rīga, 2007. gada marts. ĢM AUGU UN PĀRTIKAS IDENTIFICĒŠANAS METODES Tēmu apgūstot paredzēts:

zohar
Download Presentation

Veselības zinātņu maģistra studiju programma uzturzinātnē Studiju kurss: Jaunā un ģenētiski modificētā pārtika

An Image/Link below is provided (as is) to download presentation Download Policy: Content on the Website is provided to you AS IS for your information and personal use and may not be sold / licensed / shared on other websites without getting consent from its author. Content is provided to you AS IS for your information and personal use only. Download presentation by click this link. While downloading, if for some reason you are not able to download a presentation, the publisher may have deleted the file from their server. During download, if you can't get a presentation, the file might be deleted by the publisher.

E N D

Presentation Transcript

  1. Veselības zinātņu maģistra studiju programma uzturzinātnē Studiju kurss: Jaunā un ģenētiski modificētā pārtika ĢENĒTISKI MODIFICĒTĀ PĀRTIKA INDRIĶIS MUIŽNIEKS, Rīga, 2007. gada marts

  2. ĢM AUGU UN PĀRTIKAS IDENTIFICĒŠANAS METODES Tēmu apgūstot paredzēts: apzināt ĢM augu un pārtikas identificēšanas metožu galvenās grupas: morfoloģisko / fenotipisko identificēšanu; bioķīmisko identificēšanu; imunoloģisko identificēšanu; molekulārbioloģiskai identificēšanu; detalizēti apskatīt praksē izmantojamo galveno identificēšanas metožu principus un realizācijas nosacījumus: kapilārās plūsmas metodei, ELISA metodei, PCR un konkurējošās PCR metodei, RT (laikā novērojamās PCR) metodei; apgūt ĢM pārtikas marķēšanas principu pielietojuma nosacījumus; iepazīties ar pārtikas produktu paraugu ņemšanas noteikumiem ĢM piesārņojuma analīzei; gūt priekšstatu par analīžu izmaksām, apjomiem, Latvijā izdarītajām kontrolēm

  3. Uzdevumi analītiskajam darbam • Esošie tiesību akti izvirza kontrolējošajām institūcijām sarežģītus uzdevumus. • ĢMO testēšana • kvalitatīvi (jā / nē) • kvantitatīvi (atbilstība 0,9 % pieļaujamajaikoncentrācijai, kura nav jāmarķē) • Nepieciešamas: • validētas metodes • kontroles paraugi (salīdzināmais materiāls) • īpaši testi ES teritorijā atļautu un neatļautu ĢMO atšķiršanai

  4. ĢMO KONTROLES METODES Kontrolējamās īpašības Morfoloģijas un augšanas īpatnību raksturojums: izskats; rezistence pret antibiotikām; rezistence pret specifiskiem vides faktoriem un kaitēkļiem.

  5. Kultūras īpatnības TOLERANCE PRET HERBICĪDIEM

  6. Kultūras īpatnības TOLERANCE PRET HERBICĪDIEM

  7. Kultūras īpatnības TOLERANCE PRET HERBICĪDIEM

  8. ĢMO KONTROLES METODES Kontrolējamās īpašības Proteīni: fermentu raksturojums / zimogrammas; imunoloģiskās metodes, piem., antivielas pret Bt toksīnu, EPSP sintetāzi vai patproteīnu

  9. ĢMO KONTROLES METODES Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) E - sārmainā fosfatāze; S - p-nitrofenilfosfāts

  10. Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)

  11. Puskvantitatīva raundapa rezistento sojas miltu analīze See Lipp et al., J. AOAC Int., in print

  12. IMUNOLOĢISKĀS EKSPRESMETODES

  13. Laterālās kapilārās plūsmas metode (imunoloģiskie indikatorpapīri)

  14. ĢMO KONTROLES METODES Kontrolējamās īpašības Nukleīnskābes : PCR un PCR modifikācijas, piem., 35S PROMOTERA SPECIFISKIE PRAIMERI: 5’-CCACGTCTTCAAAGCAAGTGG-3’ 5’-TCCTCTCCAAATGAAATGAACTTCC-3’ AMPLIFICĒ 180 BP SECĪBU Varbūtība 20 b.p. secības nejaušai klātbūtnei genomā – mazāka par 1 no 1012

  15. PCR izmantošana ĢMO atrašanai Metodes princips 1. Parauga homogenizēšana 2. DNS ekstrakcija 3. Ekstraģētās DNS kontrole 4. DNS fragmenta amplifikācja 5. Elektroforēze

  16. base pairs (bp) 500 400 300 200 180 bp 100 ĢMO atrašana Apm. 20 ng DNS, krāsota ar etīdijbromīdu Sample DNA Extraction % GMO content M nt 0 0.1 0.5 2 100 C+ Results Amplification Electrophoresis

  17. DNS ekstrakcija nepieciešamie materiāli un reaktīvi 1. Homogenizēts analizējamais materiāls 2. Ekstrakcijas buferis 3. Denaturējošs savienojums 4. Proteīnus noārdošs ferments

  18. DNS attīrīšana 1. Centrifugēšana 2. Supernantanta sorbcija uz nesēja 3. Minikolonnas uzpildīšana 4. Kolonnas mazgāšana un žāvēšana 5. DNS eluēšana

  19. DNS attīrīšana Jonu apmaiņas hromatogrāfija DNS attīrīšana no ĢMO paraugiem, izmantojot iepriekšsagatavotas kolonnas

  20. POLIMERĀZES ĶĒDES REAKCIJA (PCR) DNS paraugu denaturē – 94oC, 5 min, DNS pavedieni atdalās viens no otra Praimeri piesaistās DNS komplementārai secībai (hibridizācija), 45 – 65oC, 30 s DNS paraugu denaturē 94oC, 30 s Temperatūras izturīga DNS polimerāze sintezē jaunus DNS pavedienus 72oC, 30 s Taq (Thermus aquaticus) DNS polimerāze

  21. POLIMERĀZES ĶĒDES REAKCIJA (PCR)

  22. POLIMERĀZES ĶĒDES REAKCIJA (PCR)

  23. POLIMERĀZES ĶĒDES REAKCIJA (PCR)

  24. POLIMERĀZES ĶĒDES REAKCIJA (PCR)

  25. POLIMERĀZES ĶĒDES REAKCIJA (PCR)

  26. POLIMERĀZES ĶĒDES REAKCIJA (PCR)

  27. POLIMERĀZES ĶĒDES REAKCIJA (PCR)

  28. POLIMERĀZES ĶĒDES REAKCIJA (PCR) REAKCIJAS GAITA Etaps Parameteri DNS denaturēšana 5 min 95oC Amplificēšana (30 s 54oC; 60 s 72oC; 30 s 95oC)xN Ciklu skaits (N) 40 Beigu cikls 3 min 72oC Atdzesēšana 1 min 4oC Silšanas ātrums 1,5o/s Atdzesēšanas ātrums 1,5o/s

  29. POLIMERĀZES ĶĒDES REAKCIJA (PCR) Kopējais laika sadalījums ĢMO analīzei Parauga sagatavošana 2 + 3 h Iegūtās DNS kontrole 1 h Amplificēšana (PCR) 3 h Fragmentu elektroforēze 1 h Kopējais laiks 10 h Nepieciešamā materiāla daudzums > 100 mg

  30. POLIMERĀZES ĶĒDES REAKCIJA (PCR) Optimāli notiekošā PCR reakcijā DNS tiek amplificēta: Cikls Kopiju skaits Masa (g) 1. 10 2,0 x 10-18 25. 8,5 x 107 1,6 x 10-11 30. 2,7 x 109 5,2 x 10-1035. 8,6 x 1010 1,7 x 10-840. 2,8 x 1012 5,4 x 10-7

  31. % GMO content M nt 0.0 0.1 0.5 2 100 C+ base pairs (bp) 500 400 300 200 180 bp 100 Skrīnings 35S promoteraun nos terminatora atrašanaKVALITATĪVAS PCR palīdzību Roundup Ready®sojas pupās E35S promoter NOS 3’ terminator petunia EPSPS CTP CP4 EPSPS plant DNA plant DNA double35S A 35S-2 195 bp 35S-1 NOS-3 180 bp NOS-1 GM09 GM05 B 447 bp GM08 GM07 169 bp (modified from Meyer & Jaccaud, 1997) % GMO content M nt 0.0 0.1 0.5 2 100 C+ base pairs (bp) 500 400 300 195 bp 200 100 C+ = plasmid pBI 121

  32. PCR konkurējošas DNS klātbūtnē

  33. ĢMO KONTROLES METODES REAL TIME (laikā novērojamā) PCR TaqMan (Rosche) Light Cycler

  34. REAL TIME (laikā novērojamā) PCR Fluorescējošās krāsvielas Ierosina zilā gaisma – spīd zaļš

  35. REAL TIME (laikā novērojamā) PCR Fluorescējošās krāsvielas Ierosina zaļā gaisma – spīd sarkans

  36. REAL TIME (laikā novērojamā) PCR: FLUORESCENCES REZONANSES ENERĢIJAS PĀRNESE (FRET) Meklējamajai DNS specifiskā secība Apgrieztie DNS secības atkārtojumi – FRET indikācija

  37. FLUORISCĒJOŠĀS ZONDES IZMANTOŠANA RT-PCR Denaturēšana Hibridizācija R = Uztvērējs Q = Dzēsējs • Polimerizācija Q Q R Zonde forward primer Praimers 1 5’ 5’ 3’ 5’ 3’ Praimers 2 5’ Praimeri nodrošina DNS amplifikāciju, zonde – amplificētā fragmenta uzskaiti

  38. RT -PCR principi 96 identisku reakciju atkārtojumi dod būtiski atšķirīgus rezultātus reakcijas beigu posmā

  39. SLIEKŠŅA CIKLS (CT) Sliekšņa ciklā iespējams uztvert fluorescences signālapacelšanos virs fona līmeņa Labi korelē ar sākotnējo amplificējamās sekvences kopiju skaitu • Ja sekvence ir divas reizes vairāk, uztvērēja fluorescence parādās vienu ciklu ātrāk • Ja sekvence ir divas reizes mazāk, uztvērēja fluorescence parādās vienu ciklu vēlāk

  40. REAL TIME PCR: DNS secību kvantitatīva noteikšana Sliekšņa līmeņa noteikšana dod lineārus mērījumu rezultātus plašā diapazonā

  41. GMO KVANTITATĪVĀS NOTEIKŠANAS METOŽU SALĪDZINĀJUMS Farrid E. Ahmed, detection of genetically modified organisms in foods, TiBtech, 20 (5), 215 – 223, 2002

  42. GMO KVANTITATĪVĀS NOTEIKŠANAS METOŽU SALĪDZINĀJUMS

  43. Noteikumi par ministriju un citu centrālo valsts iestāžu programmu un apakšprogrammu rezultatīvajiem rādītājiem 2006.gadam Noteikumi Nr. 314 , 25.04.2006 Valsts uzraudzības kārtībā veiktās pārbaudes dažādu kategoriju pārtikas apritē iesaistītajos uzņēmumos - 42874 Pārtikas laboratoriskie izmeklējumi: No ģenētiski modificētiem organismiem ražotu pārtikas produktu kontroles programma (izmeklējumu skaits) - 100 Dioksīna kontroles programma (izmeklējumu skaits) - 60 Pārtikas apritē iesaistīto uzņēmumu laboratorisko izmeklējumu programmā paredzētie uzņēmumi, kuros tiks ņemti paraugi (skaits) - 1598

  44. Noteikumi par Pārtikas un veterinārā dienesta sniegto maksas pakalpojumu cenrādi Noteikumi nr. 62, 17.01.2006

  45. NĀKOTNES TEHNOLOĢIJAS ĢMO DETEKTĒŠANAI DNS MIKRORINDAS DNS procesori (čipi, mikrorindas)

  46. NĀKOTNES TEHNOLOĢIJAS ĢMO DETEKTĒŠANAI Nukleīnskābju un modificētu antivielu mijiedarbība Paraugus apstrādā, lai sagrautu šūnu apvalkus, atbrīvotu NS Hibrīda saistīšana Ar RNS zondi hibridizē pētāmo DNS DNS/RNS hibrīdus piesaista pie nesēja ar specifisku antivielu palīdzību

  47. NĀKOTNES TEHNOLOĢIJAS ĢMO DETEKTĒŠANAI Nukleīnskābju un modificētu antivielu mijiedarbība DNS/RNS hibrīdus piesaista pie nesēja ar specifisku antivielu palīdzību Hibrīda saistīšana DNS/RNS hibrīdi piesaista ar sārmaino fosfatāzi konjugētas Av, katrs hibrīds – līdz 3000 Av molekulu Piesaistīto fosfatāzi detektē ar hromogēnā substrāta palīdzību

  48. NĀKOTNES TEHNOLOĢIJAS ĢMO DETEKTĒŠANAI Virsmas plazmonu rezonanses spektroskopija

  49. LABĀ LABORATORIJAS PRAKSE • Good Laboratory Practice (GLP) • tiek lietota, lai līdz minimumam samazinātu kļudu iespējas, kas varētu iespaidot testēšanas rezultātus vai jebkuru citu pētniecības darbību. • Piemērojama: • Gatavojot datus ĢMO pieteikumam, atbilstoši ES Direktīvai 18/2002; • Veicot pārbaudes vai uzraudzības analīzesatbilstoši ES Regulai1829/2003

  50. Prasības laboratorijām Dalībvalstu laboratorijām, kuras veic analīzes saskaņā ar šo ieteikumu, ir jābūt akreditētām saskaņā ar EN ISO/IEC 17025/1999 vai sertificētām saskaņā ar atbilstošu shēmu, un tām ir regulāri jāpiedalās kvalifikācijas testēšanas shēmās, ko organizē vai koordinē nacionāli vai starptautiski atzītas laboratorijas un/vai valsts, starptautiskās organizācijas. Pārtikas produktus, ko iesniedz analīzei saskaņā ar šo ieteikumu, nodod laboratorijām, kas atbilst Direktīvas 93/99/EEK 3. panta nosacījumiem.

More Related