Plasmids in Gene Cloning: Essential Characteristics and Functions

1. TBT401-Rekombinant DNA Teknolojisi melita.parlak@jove.com https://app.jove.com/ https://app.jove.com/join-class?code=B224E0A1 DOÇ. DR. ASLIHAN KURTKIZILDOĞAN

2. • Genomes 4; T.A. BROWN, Garland Sciences, 2018 • Gene Cloning and DNA Analysis: An Introduction. 6th edition. By T.A. Brown. Published 2010 by Blackwell Publishing. • Güncel makaleler • Konu ile ilgili videolar KAYNAKLAR TBT408-GENOMİKLER

3. • 1. hafta: RDT genel bakış, Gen klonlama-05.10.2023 • 2. hafta: Polimeraz Zincir Reaksiyonu- 12.10.2023 • 3. hafta: Vektörler- 19.10.2023 • 4. hafta: Canlı hücrelerden DNA’nın saflaştırılması- 26.10.2023 • 5. hafta: Restriksiyon endonükleazlar- 02.11.2023 • 6. hafta: Ligasyon- 09.11.2023 • 7. hafta: Canlı hücrelere DNA nın girişi- 16.11.2023 TBT401-RDT DERS PLANI • 8. hafta: Rekombinant klonların seçimi- 23.11.2023 • Vize (26 Kasım-3 Aralık 2023) • 9. hafta: Doğrulama yöntemleri- 07.12.2023 26 Kasım 3Aralık 2023 Ara sınav haftası 12 Ocak 2024 Derslerin Bitimi • 10. hafta: Bitkilerde/Hayvanlarda gen klonlama- 14.12.2023 • 11. hafta: Gen kütüphaneleri- 21.12.2023 • 12. hafta: Genom düzenleme-CRISPR- 28.12.2023 • 13. hafta: Rekombinant protein ifadesi-04.01.2024 • 14. hafta: Uygulama sınavı 11.01.2024

4. • Genomik DNA izolasyonu • Plazmid izolasyonu • Agaroz jel elektroforezi • Polimeraz Zincir Reaksiyonu • Revers transkripsiyon-cDNA oluşturma • Restriksiyon enzim kesimi Laboratuvar Ders İçeriği • Ligasyon • Transformasyon TBT401-RDT • Rekombinant koloni seçimi

5. DEĞERLENDİRME • Ara sınav ve Uygulama_____%40 • Final Sınavı ___%60 Arasınav Laboratuvar Uygulama Final Sınavı

6. Konu başlıkları • Bölüm 1: Gen klonlama ve PCR 06.10.2022 • Bölüm 2: Gen klonlamada vektörler: Plazmitler ve bakteriofajlar 13.10.2022 • Bölüm 3: Canlı hücrelerden DNA’nın saflaştırılması 20.10.2022 • Bölüm 4: DNA nın manipülasyonu 27.10.2022/ 03.11.2022 • Bölüm 5: Canlı hücrelere DNA nın girişi 10.11.2022 • Bölüm 6: E. coli klonlama vektörleri 17.11.2022 • Bölüm 7: ÖKARYOTLAR İÇİN KLONLAMA VEKTÖRLERİ 24.12.2022 • Vize (26 Kasım-4 Aralık 2022) • Bölüm 8: BELLİ BİR GENİ İÇEREN KLON NASIL ELDE EDİLİR? 08.12.2022 • Bölüm 9: Gen kütüphaneleri 15.12.2022 • Bölüm 10: Genom düzenleme-CRISPR 22.12.2022 • Bölüm 11: Prokaryotlarda rekombinant protein ifadesi 29.12.2022 • Bölüm 12: Ökaryotlarda rekombinant protein ifadesi 05.01.2023 • Uygulama sınavı 12.01.2023 6

7. • Vize %40 • Arasınav %70 • Uygulama%30 • Final %60 • Sınav %85 • Quiz %15 2

8. •BÖLÜM 2: Gen klonlamada vektörler: Plazmitler ve bakteriofajlar https://app.jove.com/embed/player?id=5074&access=9fe8c 08e4c&t=1&s=1&fpv=1 Gene Cloning and DNAAnalysis:An Introduction. 6th edition. By T.A. Brown. Blackwell Publishing.

9. Plazmitler Gen klonlamada bir DNA molekülünün vektör olarak kullanılabilmesi için çeşitli özelliklere sahip olması gerekir: • Konak hücre içinde kolaylıkla çoğalabilmeli • Nispeten küçük (tercihen <10 kb) olmalı 9

10. : Temel özellikleri Plazmitler • Plazmitler bakteri hücrelerinde kromozomdan bağımsız olarak bulunan halkasal moleküllerdir. • Plazmitler bir ya da daha fazla gen içerirler ve bu genler konak bakterinin belirgin bir özellik kazanmasını sağlar. – Ör: Normalde toksik olan bir antibiyotik konsantrasyonunda bakterinin hayatta kalmasını sağlar. 10

11. Plazmitler : Temel özellikleri • Seçici markörlere sahiptirler (Ör; antibiyotik direnç geni). • Replikasyon orjinleri bulunur. – Plazmitlerde en az bir tane bulunan oriC plazmidin bakteri kromozomundan bağımsız replikasyonunun sağlar. – Küçük plazmitler replikasyon enzimlerinin konak bakteriden sağlarken büyük olanlar kendi replikasyon enzimlerinin sentezinden sorumlu genlere sahiptirler. 11

12. Plazmitler:Temel özellikleri • Bazı plazmitler kendilerini bakteri kromozomuna sokarak onunla birlikte replike olurlar. Bu tip plazmitler «epizom» ya da “integratif plazmitler” adını alırlar. • Çok sayıda hücre bölünmesi boyunca kromozoma entegre (kromozoma bütünleşik) kalabilirler, ancak daima bazı basamaklarda bağımsız elementler olarak var olurlar. 12

13. Plazmitler:Temel özellikleri • Bazı plazmitler kendilerini bakteri kromozomuna sokarak onunla birlikte replike olurlar. Bu tip plazmitler «epizom» ya da integratif plazmitler adını alırlar. • Çok sayıda hücre bölünmesi boyunca kromozoma entegre kalabilirler, ancak daima bazı basamaklarda bağımsız elementler olarak var olurlar. 13

14. Plazmitler 14

15. Plazmitler • Büyüklük ve kopya sayıları: • Bir plazmidin büyüklük ve kopya sayısı klonlamada oldukça önemlidir. • Plazmitler 1 kb ila >250 kb büyüklüğünde olabilirler.. • Bazı büyük plazmitlerin klonlamada kullanılabilmeleri ancak bazı koşullarda mümkün olabilir. İdeal bir klonlama vektörü 10 kb büyüklüğünde olmalıdır. • Kopya sayısı; tek bir bakteri hücresinde normalde bulunan bir plazmidin molekül sayısını ifade eder. • Kopya sayısını kontrol eden faktörler henüz net olarak anlaşılmamıştır. • Bazı plazmitler, özellikle daha büyük olanlar, «stringent» olarak ifade edilirler ve düşük kopya sayısına sahiplerdir (1-2 kopya/hücre), «relaxed» olarak tanımlananlar ise çoklu kopyalıdırlar (≥50 kopya/hücre) 15

16. Plazmitler • Büyüklük ve kopya sayıları: – Genel olarak bakıldığında klonlama için bir plazmidin hücrede çok kopyalı olması tercih edilir. Bu sayede rekombinant DNA molekülü büyük miktarlarda elde edilebilir. • Konjugasyon ve kompatibilite: • Plazmitler iki gruba ayrılırlar: – Konjugatif plazmitler – Non konjugatif plazmitler (konjugasyon özelliği olmayan plazmitler) 16

17. Plazmitler • Konjugatif plazmitler: – tra genlerine sahiptirler. Bu sayede bakteri kültüründe bir hücreden diğerine aktarılırlar. «konjugasyon» – Bu genler sadece konjugatif plazmitlerde bulunur, non konjugatiflerde bulunmaz. – Bazı durumlarda, aynı hücrede bulunan non konjugatif plazmitler konjugatif plazmitlerle birlikte konjugasyonla diğer hücreye aktarılabilirler. 17

18. Konjugasyon 18

19. Plazmitler • Konjugasyon ve kompatibilite: • Tek bir hücrede farklı tiplerde plazmit bulunabilir ve bunlar içerisinde birden fazla farklı konjugatif plazmit olabilir. • Esasında, E. coli’de yedi farklı plazmidin aynı anda bulunduğu bilinmektedir. Plazmitlerin bir hücrede bir arada bulunabilmeleri için «kompatible» yani «uyumlu» olmaları gereklidir. • Aski durumda eğer iki plazmit birbiri ile uyumsuz ise hızla hücreden atılırlarlar. • Incompatibilite (uyumsuzluk) temeli çok iyi anlaşılamamıştır ve plazmit replikasyonu sırasında yaşanan bir fenomen olarak yerini korumaktadır. 19

20. Plazmitler • Sınıflandırılmaları: • Sahip oldukları genler sayesinde fenotipik olarak ayırt edici özellikler kazanan beş başlı plazmit sınıfı bulunmaktadır. – F plazmidleri - R plazmitleri - Col plazmitleri - Degredatif Plazmitler - Virülent plazmitler 20

21. Plazmitler: F plazmitleri – F F plazmidleri plazmidleri (fertilite plazmitleri): Sahip oldukları tra genleri ile konjugasyon özelliğine sahip plazmitlerdir. Ör; E. coli F plazmidi. 21

22. Plazmitler: R plazmidleri – R R plazmidleri plazmidleri (resistans-direnç plazmitleri): Sahip oldukları bir ya da daha fazla antibiyotiğe direnç genleri sayesinde konak bakterinin bu antimikrobiyal ajanlara direnç göstermelerini sağlarlar. – Klinik mikrobiyolojide önemlidirler. Çünkü, R plazmitleri bakteriler arasında yayılarak mevcut ilaçlara antimikrobiyal direncin gelişmesine neden olurlar.Ör; Pseudomonas’ta RP4. 34

23. Plazmitler – Col Col plazmidleri: plazmidleri: Diğer bakterileri öldüren kolişin proteinini kodlarlar. Ör; E. coli Col plazmidi. – Degradatif Degradatif- -parçalayıcı parçalayıcı plazmitler: bakterinin toluen, salisilik asit gibi alışılmadık meolekülleri metabolize etmelerine olanak sağlarlar. Ör, Pseudomonas putida TOL plazmidi. – Virülans Virülans plazmitler: plazmitler: konak bakteriye patojen özellik kazandırırlar. Ör, Agrobacterium tumefaciens, Ti plazmidi, dikotiledon bitkilerde taç ur hastalığına sebep olur. plazmitler: konak 23

24. Plazmitler • Bakteriler dışında mayalarda bulunur. • Ör; Saccharomyces cerevisiae 2 μm halkasal plazmit 24

25. Plazmitler • Klonlama vektörleri • Ekspresyon vektörleri • Konak hücreye yabancı DNAyı sokarlar • Gen ifadesini ve protein ekspresyonunu sağlayan vektörlerdir • Enhanser, promotor, transkripsiyon başlangıç dizisi, transkripsiyon kodonu, terminasyon kodonu, ori, seçici markör ve restriksiyon bölgeleri içerirler • Ori, seçici markör ve restriksiyon bölgesi içerirler • Plazmitler, bakteriyofajlar, kozmitler, BAC • Çoğunlukla plazmitlerdir

26. Klonlama vektörleri • Plazmit • Bakteriyofaj • Kozmit • Bakteri Yapay Kromozomu (BAC) • Maya Yapay Kromozomu (YAC) • İnsan Yapay Kromozomu (HAC) • Retroviral vektörler

27. Klonlama vektörleri- örnekler

28. Ekspresyon vektörleri- örnekler

29. Bakteriyofajlar • Bakteriyofajlar, ya da fajlar, sadece bakterilerde hastalık yapan (spesifik olarak bakterileri enfekte eden) virüslerdir. • Diğer tüm virüsler gibi, fajlar çok basit yapıdadırlar. – Birkaç gen içeren DNA ya da RNA içerir. – Genetik materyali protein moleküllerinden yapılmış koruyucu kılıf ya da kapsid ile çevrilidir. 29

30. Bakteriyofajlar •  faj M13 fajı 30

31. Faj enfeksiyon döngüsü • Faj partikülü bakterinin dışına tutunur ve DNA/RNA sını içeriye enjekte eder. • Faj DNA molekülü replike olur, replikasyon genellikle faj kromozomundaki genler tarafından kodlanan spesifik faj enzimleri tarafından gerçekleştirilir. • Diğer faj genleri kapsidin protein bileşenlerini sentezini yönetirler. • Yeni faj partikülleri bir araya gelir ve bakteriden dışarı çıkarlar. 31

32. Bir bakteri hücresinin bakteriyofaj tarafından nasıl enfekte edildiğine dair genel şematik gösterim • 32

33. Litik döngü • Bazı faj tipleri ile bu enfeksiyon döngüsü 20 dk. dan daha az bir sürede gerçekleşir, bu hızlı enfeksiyon döngüsü «litik döngü» adını alır. Çünkü bu döngüde bakteri hücreleri parçalanır (lize olur) ve yeni fajlar ancak bu şekilde dışarı çıkabilirler. • Litik enfeksiyon döngüsünün karakteristik özelliği faj DNA replikasyonunun hemen ardından kapsid proteinlerinin sentezlenerek DNA molekülünün çevrelenmesi, montaj ve bakteri lizisidir. https://app.jove.com/embed/player?id=10823&access=8a2c 794881&t=1&s=1&fpv=1 33

34. Lizogenik fajlar • Litik döngünün aksine, lizogenik enfeksiyon muhtemelen binlerce hücre bölünmesi boyunca molekülünün konak bakteri içinde kalmasıyla karakterizedir. • Birçok lizogenik fajda, faj DNA sı tıpkı epizomal eklenme gibi bakterinin kromozomuna kendini entegre eder. Faj DNA sının entegre formu olan profaj sessizdir, ve profajı taşıyan bakteri (lizogen) genellikle enfekte olmamış bir bakteri hücresinden fizyolojik olarak ayırt edilemez. • Ancak, profaj en sonunda konak genomundan çıkar ve litik moda geçerek konak bakteri hücresini parçalar. faj DNA https://app.jove.com/embed/player?id=10824&t=1&s=1&f pv=1 34

35. Lizogenik yaşam döngüsü ve bakteriyofaj  35

36.  DNAmolekülünde gen organizasyonu Baş ve kuyruk fajının en tipik örneğidir. DNA polihedral baş yapısında yer alır ve kuyruk kısmı bakteri yüzeyine tutunmak ve DNA yı bakteri içine enjekte etmek için işlev görür. DNA sı 49 kb büyüklüğündedir. • • • Genler fonksiyonlarına göre kümelenmiş halde genomda bulunurlar. • Kapsid bileşenlerini kodlayan tüm genler genomun sol tarafında entegrasyonundan sorumlu enzimleri kodlayan genler orta bölgede konumlanmıştır. profajın konak genomuna • İlişkili genlerin genomda belli bir bölgede kümelenmesi genomun ifadesinin kontrolünde oldukça önemlidir, bu durum genlerin bireysel olarak değil, grup olarak aktif ya da inaktif tutulmasını sağlar. Bu tip kümelenme  temelli klonlama vektörlerinin oluşturulmasında ayrıca önemlidir. • 36

37.  DNAnın doğrusal ve halkasal formları Doğrusal  molekülü Watson Crick modeline göre birbirinin komplementeri olan çift zincirli DNA dan oluşmakla birlikte her iki ucunda 12 nükleotidlik tek zincirli iki serbest uca sahiptir. İki tek zincir birbirine komplementer olup birbirleri ile baz eşleşmesi yaparak doğrusal DNA nın çift zincirli halkasal forma dönüşmesini sağlarlar. • 37

38. • Komplementer tek zincirler «yapışkan uç» «kohesiv uç» adını alırlar ve cos site olarak ifade edilirler. Enfeksiyon döngüsünde iki faklı rolleri vardır: • İlk olarak, doğrusal DNA molekülünün bakteri genomuna girmeden önce halkasallaşması gerektiğinden konak hücreye enjekte edilmeden önce halka haline getirirler. 38

39. • İkinci olarak, profaj konak genomundan çıktıktan sonra çok sayıda yeni  DNA molekülü replikasyonun rolling circle mekanizması (sürekli DNA zinciri kalıp molekülü «sarar») ile üretilir. Sonuç olarak, cos bölgelerinden birleşmiş bir seri doğrusal  genomundan oluşan katekan meydana gelir. Burada cos bölgelerinin rolü bireysel  genomları meydana getirmek üzere katekanları cos bölgelerinden kesen bir endonükleaz için tanıma bölgesi olmaktır. Bu endonükleaz  DNA molekülündeki A geninin ürünüdür. Tek zincirli yapışkan uçlar oluşturur ve aynı zamanda her bir  genomunun bir faj kafa yapısına paketlenmesi için diğer proteinlerle birlikte rol alır. Bu kesim ve paketleme işlemleri sadece cos bölgelerini ve onun her iki yanındaki DNA dizilerini tanır, söz gelimi, yeni gen ekleyerek  genomunun iç bölgelerini değiştirir. Bu durum  genomunun total büyüklüğü çok fazla değişmediği sürece zararsızdır. • • • 39

40. 40

41. Klonlama vektörleri olarak diğer virüsler • İnsan adenovirüsleri-gen terapisi • Bakulovirüsler- böcekte önemli tıbbi proteinlerin sentezi • Kaulimovirüsler-geminivirüsler: bitkilere klonlama 41