Neonatale screening naar de ziekte van Duchenne OP PUNT STELLING EN VALIDATIE VAN EEN CREATINE KINASE BEPALING

1. Neonatale screening naar de ziekte van Duchenne OP PUNT STELLING EN VALIDATIE VAN EEN CREATINE KINASE BEPALING Thijs Decuyper O.l.v. Dr. D. Bernard en ABO E. Verhoye

2. Theoretisch gedeelte INHOUDSOPGAVE 1. Neonatale screening 2. De ziekte van Duchenne 3. Enzymatische creatine kinase bepaling Praktisch gedeelte 4. Op punt stellen van de methode 5. Validatie van de gekozen methode 6. Besluit en discussie

3. 1. Neonatale screening 2. De ziekte van Duchenne 3. Enzymatische creatine kinase bepaling Theoretisch gedeelte

4. 1. Neonatale screening Neonatale screening • Opsporen aangeboren aandoeningen • Voorwaarden voor neonatale screening • 11 aandoeningen opgespoord • Via hiel- of handrugprik

5. 2. De ziekte van Duchenne Duchenne’s spierdystrofie (DMD) • X-gebonden recessief overgeërfde spierziekte • Gen dystrofine op Xp21 • Bijna alleen bij jongens • Incidentie 1/3500 – 4000 • Geen dystrofine aanmaak  spierschade bij elke samentrekking (CK vrijstelling) • Pseudohypertrofie  spiercellen verdwijnen  vet- en bindweefsel

6. 2. De ziekte van Duchenne Duchenne’s spierdystrofie (DMD) • Leeftijd bij sterven: ongeveer 20 jaar • Supportieve therapie is mogelijk (fysiotherapie, …) • Curatieve therapie is de toekomst (exon skipping)

7. 3. Enzymatische creatine kinase bepaling Creatine kinase • CK vrij, door spiercelnecrose • 20 tot 100 x verhoogd • Creatine kinase katalyseert • Klassieke CK bepaling via UV-spectrofotometrie en op plasma (NU: vol bloed + hemolyse) ATP + creatine  ADP + fosfocreatine

8. 3. Enzymatische creatine kinase bepaling Creatine kinase • Enzymatische creatine kinase bepaling door middel van fluorometrie (NADPH) • Het signaal van NADPH is recht evenredig met [CK] • golflengten van ex.= 355 nm en em.= 460 nm • Interferenties (adenylaatkinase, ...) creatine fosfaat + ADP <-CK-> creatine + ATP glucose + ATP <-HK-> glucose-6-P + ADP glucose-6-P + NADP+ <-6GP-DH-> gluconate-6-P + NADPH + H+

9. 1. Op punt stellen van de methode 2. Validatie van de gekozen methode Praktische gedeelte Gebruikte stalen in het praktische gedeelte zijn gespotte bloedstalen op bloedkaarten. (zelf aangemaakt of screeningskaarten van pasgeborenen).

10. Eenstapsmethode Eenstapsreactie Plaat schudden + incubatie PUNCHEN bloedkaarten + 75 µL reagens (R1 + R2 + NaF) Plaat centrifugeren + 150 µL EtOH Plaat schudden 15 min laten staan Aflezen met fluorometer

11. 4. Op punt stellen van de methode Op punt stellen van de methode Verhouding reagens/ethanol volume Verschil in incubatietijden/temperaturen Centrifugeren Fluorescentie versus UV aflezing Verschil in natriumfluoride concentraties Heparine standaarden versus EDTA standaarden Blanco’s vergelijken Eenstapsreactie versus tweestapsreactie

12. 4. Op punt stellen van de methode Verhouding reagens/ethanol volume Geteste verhoudingen: 75/75 en 75/150 Interpretatie: ½ verhouding beter, ethanol: reactie stoppen + eiwitneerslag Plaat schudden + incubatie PUNCHEN bloedkaarten + 75 µL reagens (R1 + R2 + NaF) Plaat centrifugeren + 150 µL EtOH Plaat schudden 15 min laten staan Aflezen met fluorometer

13. 4. Op punt stellen van de methode Verschil in incubatietijden/temperaturen Geteste verschillen: 30 minuten op 30 °C 20 minuten op 35 °C Interpretatie: 30 min op 30°C is de beste optie. CK kan beter elueren, meer CK die vrijkomt. Plaat schudden + incubatie PUNCHEN bloedkaarten + 75 µL reagens (R1 + R2 + NaF) Plaat centrifugeren + 150 µL EtOH Plaat schudden 15 min laten staan Aflezen met fluorometer

14. 4. Op punt stellen van de methode Centrifugeren Geteste verschillen: meten na alcoholprecipitatie, na centrifugeren en niet centrifugeren Interpretatie: Betere resultaten voor het centrifugeren. Echter, door quenching beter resultaten verwacht na centrifugeren. Mogelijke verklaring: verdamping van ethanol Plaat schudden + incubatie PUNCHEN bloedkaarten + 75 µL reagens (R1 + R2 + NaF) Plaat centrifugeren + 150 µL EtOH Plaat schudden 15 min laten staan Aflezen met fluorometer

15. 4. Op punt stellen van de methode Fluorescentie versus UV aflezing Geteste verschillen:aflezen met fluorometer en UV-spectrofotometer. Interpretatie: Het is beter om met fluorometrie te meten. Eliminatie van doorzuigstap of pipeteerstap. Plaat schudden + incubatie PUNCHEN bloedkaarten + 75 µL reagens (R1 + R2 + NaF) Plaat centrifugeren + 150 µL EtOH Plaat schudden 15 min laten staan Aflezen met fluorometer

16. 4. Op punt stellen van de methode Verschil in natriumfluoride concentraties Geteste verschillen: 25 mmol/L, 125 mmol/L en 250 mmol/L. Interpretatie: Het is beter om met 250 mmol/L NaF te werken voor de betere inhibitie van adenylaatkinase. Plaat schudden + incubatie PUNCHEN bloedkaarten + 75 µL reagens (R1 + R2 + NaF) Plaat centrifugeren + 150 µL EtOH Plaat schudden 15 min laten staan Aflezen met fluorometer

17. 4. Op punt stellen van de methode Heparine standaarden versus EDTA standaarden Geteste verschillen: Heparine standaarden en EDTA standaarden. Interpretatie Het is beter om met EDTA gewassen standaarden te werken. CK oplossing niet goed verspreid ondanks het vele mengen. Plaat schudden + incubatie PUNCHEN bloedkaarten + 75 µL reagens (R1 + R2 + NaF) Plaat centrifugeren + 150 µL EtOH Plaat schudden 15 min laten staan Aflezen met fluorometer

18. 4. Op punt stellen van de methode Blanco’s vergelijken Geteste verschillen: EDTA gespotte blanco’s en ongespotte blanco’s . Interpretatie: Het is beter om met de ongespotte blanco’s te werken aangezien deze onmogelijk CK bevatten. Plaat schudden + incubatie PUNCHEN bloedkaarten + 75 µL reagens (R1 + R2 + NaF) Plaat centrifugeren + 150 µL EtOH Plaat schudden 15 min laten staan Aflezen met fluorometer

19. Eenstapsmethode Eenstapreactie versus tweestapsreactie Plaat schudden + incubatie PUNCHEN bloedkaarten + 75 µL reagens (R1 + R2 + NaF) + 150 µL EtOH Plaat schudden 15 min laten staan Aflezen met fluorometer

20. Tweestapsreactie Eenstapreactie versus tweestapsreactie Geteste verschillen: Eenstapsreactie en tweestapsreactie. Interpretatie: Het is beter om met de tweestapsreactie te werken. Beter elueren + reactivatie in pre-incubatiestap. Plaat schudden + pre-incubatie PUNCHEN bloedkaarten + 50 µL reagens A (R1 + NaF) Aflezen met fluorometer 15 min laten staan Millipore plaatafzuigsysteem Plaat schudden + 150 µL EtOH Incubatie zonder schudden + werkreagens B (75 µL R2)

21. 4. Op punt stellen van de methode Besluit Betere resultaten met: • ½ reagens/ethanol verhouding • 30 minuten op 30°C • zonder centrifugeren • Fluorescentie aflezing • 250 mmol/L NaF • EDTA standaarden • Ongespotte blanco’s • Tweestapsreactie

22. Tweestapsreactie Tweestapsreactie Plaat schudden + pre-incubatie PUNCHEN bloedkaarten + 50 µL reagens A (R1 + NaF) Aflezen met fluorometer 15 min laten staan Millipore plaatafzuigsysteem Plaat schudden + 150 µL EtOH Incubatie zonder schudden + werkreagens B (75 µL R2)

23. 5. Validatie van de gekozen methode Validatie van de methode Intra-run Between-run Juistheid Eigen referentiewaarden Reproduceerbaarheid externe controles Meetbereik Lineariteit Stabiliteit

24. 5. Validatie van de gekozen methode Intra-run Werkwijze 1 staal 21 x meten in 1 run concentratie counts Gemiddelde 325 2503 SD 31 112 CV% 9 4 Interpretatie: CV% onder 10 %.

25. 5. Validatie van de gekozen methode Between-run Werkwijze 1 staal over 21 runs 1 x meten in elke run concentratie counts Gemiddelde 490 4000 SD 44 390 CV% 9 9 Interpretatie: CV% onder 10 %.

26. 5. Validatie van de gekozen methode Juistheid Werkwijze CDC waarde vergelijken met de zelf gemeten waarde Interpretatie: Correlatie moet 1 benaderen (0,991). Positieve bias door zelf gemaakte standaarden => geen kwantitatief meting mogelijk. Geen externe standaarden internationaal beschikbaar.

27. 5. Validatie van de gekozen methode Eigen referentiewaarden Werkwijze 698 stalen screenen en uitzetten in histogram Aantal gescreend: 698 Gemiddelde counts: 2231 SD: 356 99ste percentieel: 3179 Interpretatie: 99ste percentieel: 3179 counts Gemiddelde + 3 SD: 4722 counts

28. 5. Validatie van de gekozen methode Reproduceerbaarheid van externe controles Werkwijze Vergelijken van CDC controles over 21 verschillende runs CV% Base 9 Low 7 Intermediate 9 High 9 Interpretatie: CDC controles liggen onder CV% onder 10 %.

29. 5. Validatie van de gekozen methode Meetbereik (bovengrens) Werkwijze Reeks aanmaken met zeer hoge CK-concentraties, [CK] uitzetten op aantal counts Interpretatie: bovengrens ligt ongeveer op 8000 counts

30. 5. Validatie van de gekozen methode Lineariteit Werkwijze Gemeten concentraties CK uitzetten tov. aantal counts Interpretatie: Rechtlijnig verband tussen counts en concentratie CK in plasma.

31. 5. Validatie van de gekozen methode Stabiliteit Werkwijze Staal over 3 dagen gemeten en opgeslagen in verschillende temperaturen CV% Oven 4 Kamertemp. 2 Koelkast 12 Diepvries 3 Interpretatie: CV % ligt bij de meeste onder 10 %. Beperkte tijdspanne -> goede resultaten. Interpretatie: Rechtlijnig verband tussen counts en concentratie CK.

32. 6. Besluit Besluit en discussie • Neonatale screening naar de ziekte van Duchenne is pas te overwegen als een curatieve therapie bestaat. • Beste performantie met tweestapsreactie en fluorometrische aflezing. • Discussiepunten: - niet kwantitatief (pos. bias tov. CDC controles) (ideaal beschikbare externe standaarden) - verder op punt stelling van methode voor aanmaak standaarden (geen theoretische [CK], maar gemeten [CK] in plasma van standaard).

33. HOWEST.be Thijs Decuyper Stageplaats: AZ Sint-Jan Brugge AV Dienst: Klinische scheikunde, afdeling neonatale screening Stagementor: Dr. D. Bernard ABO E. Verhoye Eindwerktitel: Op punt stelling van een enzymatische CK bepaling voor de neonatale screening naar de ziekte van Duchenne Bedankt voor jullie aandacht! Vragen?