L.S. in Scienze e tecnologie alimentari Anno Accademico 2008/2009 Corso integrato:

1. L.S. in Scienze e tecnologie alimentari Anno Accademico 2008/2009 Corso integrato: Controllo delle modificazioni chimiche negli alimenti (7 CFU) Modulo: Chimica analitica strumentale (4 CFU) Giorgio Bonaga CROMATOGRAFIA TEORIA GENERALE (CAS-2) Giorgio Bonaga

2. CROMATOGRAFIA (Tswett’s writing = Tswett’s analysis) … ma chi è Tswett ? Giorgio Bonaga

3. CROMATOGRAFIA (chromos= colore + graphos = scrittura mediante il colore) PER I PIU’ CURIOSI: Karlo Ivanovich Sakodynskii:”Michael Tswett: life and work”. Carlo Erba Edizioni, Milano (gratuito, a richiesta) Mikhail Semynovich Tswett (1872-1919) Nasce ad Asti (Italia) il 14 maggio 1872, da Siméon, russo, e Maria de Derozza, italiana. Studia a Losanna, poi all’Università di Ginevra, dove si laurea in Scienze nel 1896, discutendo una tesi sulla struttura delle cellule vegetali (protoplasmi e cloroplasti). Nello stesso anno si trasferisce a San Pietroburgo, ma in Russia non gli è riconosciuto il titolo di studio svizzero e pertanto nel 1901 sostiene una nuova tesi di laurea dal titolo “Struttura fisico-chimica della particella di clorofilla. Studio sperimentale e critico”.Nel 1901 si trasferisce a Varsavia, in qualità di assistente presso il Dipartimento di Anatomia e Fisiologia Vegetale, per divenire poi “Lettore” in Botanica e Agricoltura presso L’8 mar l’Istituto di Veterinaria ed infine “Lettore Senior” al Dipartimento di Chimica e Mineralogia. Il 21 marzo 1903 Tswett presenta il lavoro che di fatto costituisce la data di nascita della “cromatografia”: l’occasione è un Convegno presso la Sezione di Biologia della Società Naturalistica dell’Università di Varsavia ed il titolo della sua relazione è “Sulla nuova categoria di fenomeni di adsorbimento e sulle loro applicazioni nell’analisi chimica”. Nel 1915 ritorna a Mosca, per trasferirsi poi, due anni dopo, all’Università di Tartu (Estonia) in qualità di Full Professor e nel 1918 all’Università di Voronezh (Estonia), città nella quale muore il 26 giugno 1919. Giorgio Bonaga

4. L’IDEA DI TSWETT Il primo “cromatografo” di Tswett (1903) eluente (etere di petrolio) d = 2-3 cm xantofilla  clorofilla  clorofilla  xantofilla  ‘ xantofilla  L = 30-40 cm materiale adsorbente (CaCO3) P = 0,5 Atm Il primo “cromatogramma” Giorgio Bonaga

5. Il “cromatografo” di Tswett per colonne multiple, con sistema di pressione Giorgio Bonaga

6. In uno dei suoi ultimi lavori M. S. Tswett ha scritto (profeticamente): “…tuttavia, è auspicabile un grande sviluppo, nell’ambito dell’analisi cromatografica, di colonne capillari “ L’8 mar colonne capillari Giorgio Bonaga

7. CROMATOGRAFIA eluente (fase mobile) V R segnale del detector allumina granulare (fase stazionaria) cromatogramma setto di vetro poroso DETECTOR Giorgio Bonaga

8. solido o liquido gas o liquido iniettori (injector) rivelatori (detector) CROMATOGRAFO A BLOCCHI rivelazione degli analiti • colonna • fase stazionaria– introduzione del campione serbatoio - fase mobile - Giorgio Bonaga

9. Le tecniche cromatografiche permettono la separazione e l’analisi quali-quantitativa dei componenti di matrici complesse. Nell’indagine biologica sono particolarmente preziose le loro numerose applicazioni nel campo alimentare.In tutti i metodi cromatografici, seppure con alcune differenze, i componenti di una miscela si separano distribuendosi tra due fasi: • una FASE STAZIONARIA (un solido o un liquido su un supporto solido inerte) • una FASE MOBILE (un gas o un liquido) che fluisce in modo continuo sulla fase stazionaria. • La separazione è dovuta principalmente a due effetti: • 1 . distribuzione dei solutifra la fase stazionaria e la fase mobile; • effetto di trascinamento dei soluti da parte della fase mobile. Giorgio Bonaga

10. CLASSIFICAZIONE DEI PROCESSI CROMATOGRAFICI Giorgio Bonaga

12. CROMATOGRAFIA DI RIPARTIZIONE (LC o GC) fase mobile (liquido o gas) fase stazionaria (liquido) supporto (solido) Le molecole di soluti diversi si ripartiscono in modo diverso tra la fase stazionaria liquida (supportata da un solido) e la fase mobile liquida o gassosa. Giorgio Bonaga

13. CROMATOGRAFIA DI ADSORBIMENTO (LSC o GSC) fase mobile (liquido o gas) siti attivi fase stazionaria (solido) • I siti attivi della fase stazionaria solida “legano” le molecole dei solventi e dei soluti con legami reversibili non polari e polari di “forza” diversa: • forze deboli (tipo Van der Waals) e dipolo istantaneo-dipolo istantaneo per solventi e soluti non polari; • dipoli permanenti per solventi e soluti polari; • legami H per molecole con H su eteroatomi (N, O, F); • interazioni dielettriche per solventi polarizzabili. Giorgio Bonaga

14. PRINCIPI TEORICI DELLA CROMATOGRAFIA • La fase stazionaria è costituita da particelle solide o da un film liquido che riveste un supporto solido, contenute all’interno di un tubo lungo e sottile (cromatografia su colonna) o depositate su una superficie (cromatografia planare). Nel passaggio attraverso la colonna ogni componente X si distribuisce fra la fase stazionaria (s) e la fase mobile (m): • Xm • Le due caratteristiche del processo cromatografico sono: • Migrazione differenziale • Allargamento della banda Xs tempo Giorgio Bonaga

15. MIGRAZIONE DIFFERENZIALE Costituisce la base del processo di separazione cromatografica ed è strettamente legata alla differenza dei tempi di ritenzione di soluti diversi (selettività). In sintesi, è diversa la velocità di migrazione di soluti diversi lungo la fase stazionaria della colonna. Simuliamo gli equilibri tra i 3 soluti A B C, la fase mobile e una singola particella di fase stazionaria: [Bm] [Cm] [Am] [Cs]>[Bs]>[As] [Am]>[Bm]>[Cm] [As] [Bs] [Cs] Giorgio Bonaga

16. Nell’esempio illustrato, all’equilibrio (in realtà i processi cromatografici sono processi di “non equilibrio”, ma per ora è utile considerarli equilibri nella descrizione qualitativa dei fenomeni che intervengono), l’analità A è prevalentemente nella fase mobile, B si ripartisce in modo uguale nelle due fasi e C è prevalentemente nella fase stazionaria. • La velocità con cui un analita si muove lungo la colonna dipende dalla frazione di molecole che si trova nella fase mobile ad ogni istante (quelle che interagiscono con la fase stazionaria non si muovono lungo la colonna, se non al sopraggiungere di un nuovo volume di fase mobile). • La migrazione differenziale dipende dall’equilibrio di distribuzione di ogni analita tra la fase stazionaria e la fase mobile e perciò essa è controllata dalle 3 variabili sperimentali che influenzano la distribuzione (ossia le variabili che influenzano l’equilibriodi distribuzione termodinamicodel soluto tra le due fasi): • COMPOSIZIONE DELLA FASE MOBILE • COMPOSIZIONE DELLA FASE STAZIONARIA • TEMPERATURA • Per modificare la migrazione differenziale allo scopo di migliorare la separazione tra soluti, si deve operare su queste 3 variabili. Giorgio Bonaga

17. COEFFICIENTE DI PARTIZIONE (O DI DISTRIBUZIONE) Esprime la COSTANTE TERMODINAMICA Kd, ovvero il rapporto tra la concentrazione molare dell’analita X nella fase stazionaria e la concentrazione molare dell’analita X nella fase mobile. Cs Kd(X) = Cm Nell’esempio precedente i coefficienti di partizione degli analiti A, B e C sono: Kd(A) = 1/3 = 0,33 (più veloce di B e C) Kd(B) = 2/2 = 1,00 (3 volte più lento di A) Kd(C)= 3/1 = 3,00 (9 volte più lento di A) Giorgio Bonaga

18. velocità media Anche le molecole dello stesso soluto si muovono lungo la colonna con velocità differenti: la loro dispersione genera un profilo (banda di eluizione) di tipo gaussiano, il cui apice rappresenta la velocità media del soluto. Il termine comune della banda di eluzione è picco cromatografico. t Giorgio Bonaga

19. tR t0 W TEMPO DI RITENZIONE detector signal 0 0 t • Tempo di ritenzione(tR): tempo necessario ad un soluto per eluire da una estremità all’altra della colonna (ed essere “visto” dal detector). • Tempo morto (t0o tM): tempo di ritenzione di un soluto che non è trattenuto dalla fase stazionaria e pertanto fluisce alla stessa velocità della fase mobile. Giorgio Bonaga

20. Volume di ritenzione (VR): volume di fase mobile necessario per eluire il soluto da un’estremità all’altra della colonna. • Volume morto (V0oVM): volume di ritenzione di un soluto che non è trattenuto dalla fase stazionaria. Esso coincide con il volume di fase mobile che occupa la colonna. • (es.: colonna di r = 0,5 cm e di lunghezza 100 cm, V0= 0,5 cm x 0,5 cm x 3,14 x 100 cm = 25 cm3 = 25 ml). VR e tR sono tra loro proporzionali se il flusso della fase mobile è costante, in base alla relazione: VR = tR x F F = flusso della fase mobile (volume nell’unità di tempo, espresso in ml/min) (es.: soluto con tR = 5 min, a F = 30 ml/min, il VR= 5 min x 25 ml/min = 125 ml) Giorgio Bonaga

21. RELAZIONE TRA FLUSSO (F) E VELOCITA’ MEDIA LINEARE (v) La relazione tra F (in ml/min) e v(in cm/sec) della fase mobile è: • A = area effettiva della sezione media della colonna (area disponibile per il flusso • della fase mobile) • A = Ag .e • Ag = area geometrica della sezione della colonna • e = (interparticle porosity) rapporto tra la sezione disponibile per la fase mobile e la • sezione totale della colonna F v = (A x 60) ESEMPIO Dati F = 1,0 ml/min e una colonna di sezioni: e = 2,5 mm/5,0 mm = 0,5 Ag = 2,5 mm2. 3,14  20 mm2= 0,2 cm2 A = 0,2 cm2. 0,5 = 0, 1 cm2 da cui: 2,5 mm 5,0 mm 1,0 cm3. min-1 v = 10,0 cm/sec 0,1 cm2. 60 Giorgio Bonaga

22. L v(soluto)= tR La velocità lineare media v(in cm/sec) di flusso della fase mobile è anche espressa dalla relazione: L v = t0 Nell’esempio precedente, se la lunghezza della colonna L = 100 cm, misurando sul cromatogramma il valore di t0 = 10” si ottiene: da cui, anche: 100 cm v =  10,0 cm/sec 10” F= 10,0 cm.sec-1. (0,1 cm2. 60)  1,0 ml/min È intuitivo che la velocità media lineare (in cm/sec) del solutoè espresso dalla relazione: Nell’esempio precedente, con L = 100 cm, misurando sul cromatogramma il valore di tR = 100” si ottiene: 100 cm v (soluto)=  1,0 cm/sec 100” Giorgio Bonaga

23. tR – t0 k’= t0 FATTORE DI CAPACITA’ (k’) Retention Factor Il parametro più significativo per descrivere la velocità di migrazione del soluto lungo la colonna è il fattore di capacità (k’), che esprime il tempo di ritenzione (tR) di un soluto in funzione del tempo morto (t0): tR A t0 t 1’ k’A = 6 – 1 = 5 6’ 0 1 Giorgio Bonaga

24. Dunque k’ rappresenta un tempo di ritenzione relativo(al segnale del solvente) e consente di confrontare il comportamento di due colonne differenti rispetto le quali un soluto non rivela gli stessi tR e t0. Il fattore k’ può essere espresso anche utilizzando il volume di ritenzione e il volume morto: VR – V0 k’= V0 (es.: dati VR = 250 ml e V0 = 50 ml, il k’ = 250 – 50/50 = 200/50 = 4) Il fattore k’ è anche espresso dal rapporto tra la concentrazione molare del soluto nel volume di fase stazionaria e la concentrazione molare del soluto nel volume di fase mobile (ammesso che si possa parlare di concentrazione in mol/l del soluto in un materiale solido): (es.: dati CS = 20 mol/l, CM = 10 mol/l, VS = 100 ml, V0 = 50 ml, il k’ = 20/10 x 100/50 = 4) CS .VS k’= CM . V0 Giorgio Bonaga

25. + Kd. VS VR = V0 CS Kd = Ricordando che: (es.: dati CS = 20 mol/l e CM = 10 mol/l, Kd = 2,0) si ottiene: (es.: dati VS = 100 e V0 = 50, k’ = 2,0 x 100/50 = 4) CM VS k’= Kd. V0 Eguagliando le due espressioni di k’: VR – V0 VS = Kd. V0 V0 da cui: (es.: dati V0 = 50 ml, Kd = 2, VS = 100, VR = 50 + 2,0 x 100 = 250 ml) Giorgio Bonaga

26. Se il soluto ha un valore della Kd molto basso (tendente a 0) risulterà VR = V0 , cioè quel soluto è indifferente al processo di ripartizione (analogamente alla fase mobile). Ogni soluto ha un valore caratteristico di k’ in una determinata colonna, dal momento che k’ e Kd sono legate dalla relazione: VS VS = F = F V0 V0 k’= Kd. F VS k’= Kd. V0 ponendo: si ottiene: V0 VS con V0 = VS , K’ = Kd con V0 = 0,5VS , K’ = 2 . Kd • è detto rapporto di fase ed è diverso da colonna a colonna; pertanto ogni soluto ha un k’ caratteristico in funzione della colonna utilizzata. Il k’ ottimale è compreso tra3-4 Giorgio Bonaga

27. ALLARGAMENTO DELLA BANDA Oltre alla migrazione differenziale dei soluti, il processo cromatografico comporta una allargamento della banda del soluto (cioè di molecole uguali che hanno lo stesso coefficiente termodinamico di partizione Kd) rispetto la sua larghezza iniziale. L’entità dell’allargamento è funzione del tempo che il soluto trascorre nella colonna, ovvero quanto maggiore è il suo tempo di ritenzione tanto maggiore è l’allargamento della banda. t0 t1 t2 Giorgio Bonaga

28. h W 2 2 L’allargamento della banda, che corrisponde al picco nel cromatogramma, è dovuto alla diversa velocità di migrazione delle molecole del soluto, per effetto di fattori fisici e cinetici la cui entità dipende dal valore del fattore di capacità k’ del soluto. tR h t0 W iniezione • I fattori fisici e cinetici che determinano l’allargamento della banda sono: • TORTUOSITA’ DEI PERCORSI • DIFFUSIONE LONGITUDINALE • TRASFERIMENTO DI MASSA IN FASE MOBILE • TRASFERIMENTO DI MASSA IN FASE MOBILE STAGNANTE • TRASFERIMENTO DI MASSA IN FASE STAZIONARIA Giorgio Bonaga

29. 1. TORTUOSITA’ DEI PERCORSI Le molecole di soluto non seguono lo stesso percorso e pertanto impiegano tempi diversi per percorrere la stessa lunghezza di colonna, ovvero nello stesso tempo percorrono lunghezze diverse della colonna. B A t0 v l dp t2 t1 Giorgio Bonaga

30. Giorgio Bonaga

31. fase mobile Dm 2. DIFFUSIONE LONGITUDINALE È la diffusione delle molecole del soluto, con direzione parallela all’asse longitudinale della colonna, nei versi che vanno dalle zone a maggiore concentrazione di fase mobile alle zone a minore concentrazione. fase mobile (meno concentrata) g fase mobile (più concentrata) v fase mobile (meno concentrata) Giorgio Bonaga

32. Dm 3. TRASFERIMENTO DI MASSA IN FASE MOBILE W v dp Giorgio Bonaga

33. 4. TRASFERIMENTO DI MASSA IN FASE MOBILE STAGNANTE Dm W v dp Giorgio Bonaga

34. DS U 5. TRASFERIMENTO DI MASSA IN FASE STAZIONARIA v dliq Q Giorgio Bonaga

35. OTTIMIZZAZIONE DEL PROCESSO CROMATOGRAFICO Sono stati discussi la MIGRAZIONE DIFFERENZIALE e, soltanto dal punto di vista qualitativo, l’ALLARGAMENTODELLA BANDA. Per la loro trattazione quantitativa, i parametri che influenzano il processo cromatografico possono essere riuniti in macrocategorie, ciascuna delle quali contribuisce, seppure in modo differente, all’aspettopiù importante della performance di una separazione cromatografica, la RISOLUZIONE. 1. FATTORE DI EFFICIENZA 2. FATTORE DI SELETTIVITA’ 3. FATTORE DI CAPACITA’ RISOLUZIONE Giorgio Bonaga

36. FATTORE DI EFFICIENZA • L’efficienza di una colonna è definita dalla forma e dall’allargamento dei picchi cromatografici. Per comprendere nei dettagli il fattore di efficienza occorre introdurre due concetti fondamentali: • A) ALTEZZA EQUIVALENTE DI UN PIATTO TEORICO • definizione • fenomeni fisici e cinetici che contribuiscono al valore dell’HETP • equazione di Van Deemter • B) NUMERO DI PIATTI TEORICI DI UNA COLONNA • definizione • equazioni Giorgio Bonaga

37. A) ALTEZZA EQUIVALENTE DI UN PIATTO TEORICO (Height Equivalent to the Theoretical Plate = HETP) Consideriamo l’avanzamento di un soluto nella colonna cromatografica. Se non vi fosse flusso di fase mobile nel I° tratto di colonna si instaurerebbe un equilibrio di partizione (nel nostro caso Kd= 2/8 = 0,25). In realtà la fase mobile fluisce e pertanto il processo di partizione procede lungo la colonna senza il raggiungimento di uno stato di equilibrio permanente. Nel II° tratto di colonna una parte del soluto trasportato dalla fase mobile migra nella fase stazionaria (con una Kd = 1,6/6,4 = 0,25). Anche nel III° tratto una parte del soluto migra nella fase stazionaria (con una Kd = 1,28/5,12 = 0,25). E così di seguito. I° 2,0 M 10,0 M 8,0 M HETP II° 6,4 M 1,6 M III° 1,28 M 5,12 M Giorgio Bonaga

38. Non bisogna dimenticare che la quantità di soluti presenti nella fase mobile e nella fase stazionaria sono espresse dalla concentrazione molare (numero di moli di soluto in un litro di soluzione). È ovvio che la concentrazione molare nella fase stazionaria del I° piatto teorico (M = 2,0) si modifica quando sopraggiunge un volume di fase mobile priva di soluti (M = 0). Dunque avviene una migrazione inversa, che va dalla fase stazionaria alla fase mobile, fino a quando il rapporto tra le concentrazioni molari nelle due fasi non eguaglia il Kd = 0,25 (0,4/1,6). In modo analogo avverrà nel II°, III°, ecc., piatto teorico. 0 M 1,6 M 2,0 M 0,4 M I° HETP II° 1,6 M 0,32 M 0 M 1,28 M III° 1,28 M 0,256 M 0 M 1,024 M Giorgio Bonaga

39. altezza del piatto teorico Il tratto di colonna nel quale si realizza una condizione “corrispondente” ad uno stato di equilibrio (cioè un equilibrio reversibile di partizione) è detto “altezza equivalente di un piatto teorico” (HETP), come se la fase mobile fosse ferma. L’espressione altezza del piatto teorico è mutuata dalla teoria delle colonne di frazionamento per distillazione, data l’analogia tra il processo di distillazione frazionata e il processo di ripartizione cromatografica, entrambi utilizzati per separare i componenti di una miscela. A (vapore) percorso liquido in ascesa miscela (A+B) piatto sfioratore B (liquido) Giorgio Bonaga

40. FENOMENI FISICI E CINETICI CHE CONTRIBUISCONO AL VALORE DELL’HETP 1. DIFFUSIONE EDDY(tortuosità dei percorsi) È riassunta nell’espressione: He = 2 dp.l l = costante legata alla regolarità dell’impaccamento della colonna dp=diametro delle particelle di fase stazionaria • La diffusione eddy: • dipende dalla regolarità dell’impaccamento (“column packing”) • è direttamente proporzionale al diametro delle particelle di fase stazionaria • è indipendente dalla velocità lineare media di flusso della fase mobile Giorgio Bonaga

41. 2. DIFFUSIONE LONGITUDINALE È riassunta nell’espressione: Dm Hd = 2 g v • = coefficiente dipendente dalla distribuzione delle particelle di fase stazionaria (fattore di ostruzione = 0,6 per impaccate; 1,0 per capillari) Dm = coefficiente di diffusione del soluto nella fase mobile = v = velocità lineare media di flusso della fase mobile k T 6 p h r • La diffusione longitudinale: • dipende dalla distribuzione delle particelle della fase stazionaria; • è direttamente proporzionale al Dmdel soluto nella fase mobile; • è inversamente proporzionale alla velocità lineare media di flusso della fase mobile (maggiore velocità minore tempo disponibile alla diffusione longitudinale). • NOTA: la Hd è di scarsa importanza nella LC perché i coefficienti di diffusione nei liquidi sono bassi, ma è molto importante nella GC per i valori elevati dei coefficienti di diffusione nei gas. Giorgio Bonaga

42. RELAZIONE TRA v E DIFFUSIONE LONGITUDINALE v bassa v alta Giorgio Bonaga

43. 3. e 4. TRASFERIMENTO DI MASSA IN FASE MOBILE E IN FASE MOBILE STAGNANTE È riassunto nell’espressione: v Hm = W dp2 Dm W = fattore dipendente dal diametro della colonna (= dc2 ) dp = diametro delle particelle di fase stazionaria Dm = coefficiente di diffusione del soluto nella fase mobile v = velocità lineare media di flusso della fase mobile • Il trasferimento di massa in fase mobile (e in fase mobile stagnanate): • dipende dal diametro della colonna; • è direttamente proporzionale al quadrato del diametro delle particelle; • è direttamente proporzionale alla velocità del flusso della fase mobile; • è inversamente proporzionale al Dm del soluto nella fase mobile; Giorgio Bonaga

44. 5. TRASFERIMENTO DI MASSA IN FASE STAZIONARIA È riassunta nell’espressione: v 2 Hs = Q U dliq Ds Q = fattore dipendente dal tipo e dalla forma delle particelle della fase stazionaria U = costante relativa alla velocità di migrazione del soluto dalla fase stazionaria verso la fase mobile (interazione soluto/fase stazionaria) dliq = spessore del rivestimento liquido depositato sul supporto solido Ds = coefficiente di diffusione del soluto nella fase stazionaria v = velocità lineare media di flusso della fase mobile • Il trasferimento di massa in fase stazionaria: • dipende dal diametro e dalla forma delle particelle di fase stazionaria; • dipende dalla velocità di migrazione (desorbimento) del soluto dalla fase stazionaria verso la fase mobile; • è direttamente proporzionale alla velocità lineare media di flusso della fase mobile; • è inversamente proporzionale al Dm del soluto nella fase stazionaria. Giorgio Bonaga

45. RAPPRESENTAZIONE DEI TERMINI l, g, W, Q, dp, dliq dp g l Q dliq W e g Giorgio Bonaga

46. k T 6 p h r RAPPRESENTAZIONE DEI TERMINI Dm, Ds, U Dm DmoDs = k = costante di Boltzmann T = temperatura h = viscosità del soluto r = raggio della particella = k = R/N = 1,38 . 10-23J/K R = costante universale dei gas N = numero di Avogadro K = temperatura assoluta Ds 3 √ Vp U= velocità di trasferimento del soluto dalla fase stazionaria alla fase mobile (dipende dall’antagonismo tra le interazioni soluto/ fase stazionaria e le interazioni soluto/fase mobile), ovvero dalla velocità di desorbimento del soluto dalla fase stazionaria U Giorgio Bonaga

47. Dai contributi all’HETP dei vari fenomeni fisici e cinetici si ottiene il valore dell’HETP totale: Dm dliq v Q U 2 v W dp2 HETP = He+Hd+ Hm+ Hs= 2 dp.l + + + 2 g v Dm Ds Ponendo: 2 dpl = A 2 g Dm = B L’equazione diviene: HETP = A + B + C .v costanti caratteristiche per ogni singola colonna e per una data fase mobile 2 Q U dliq W dp2 + = C Dm Ds v equazione di Van Deemter Giorgio Bonaga

48. B v Diagrammando l’equazione di Van Deemter si ottiene un’iperbole che correla il valore dell’HETP alla velocità lineare media v di flusso della fase mobile, ma nel diagramma sono identificabili anche le 3 costanti (A, B e C) caratteristiche di una certa colonna e di una data fase mobile. iperbole equilatera HETP (cm) retta con coefficiente angolare C altezza minima C . v retta parallela all’asse x A v (cm/sec) velocità ideale (v = √B/C ) Giorgio Bonaga

49. CORRELAZIONE TRA v E HETP Liquid Chromatography HETP (mm) v (cm/s) Gas Chromatography HETP (mm) v (cm/s) Giorgio Bonaga

50. CORRELAZIONE TRA v E SEPARAZIONE 4,0 ml/min 5,0 ml/min 1 1 1,0 ml/min 2,0 ml/min 1 2 2 1 2 3 2 3 3 3 0 4 8 0 2 4 0 1 2 0 0,5 1 1,5 minuti Giorgio Bonaga