CLATHRIN- MEDIATED ENDOCYTOSIS: MEMBRANE FACTORS PULL THE TRIGGER

1. CLATHRIN- MEDIATED ENDOCYTOSIS: MEMBRANE FACTORS PULL THE TRIGGER KOHJI TAKEI and VOLKER HAUCKE Andréa, Claudia, Claudiney, Daniela e Hugo

2. Transporte de vesículas cobertas por Clatrina

3. NUCLEAÇÃO I. PREMATURA I. TARDIA FISSÃO ETAPAS ENVOLVIDAS ENDOCITOSE MEDIADA POR CLATRINA

4. A reciclagem das vesículas sinapticas é um mecanismo rápido de endocitose mediado por clatrina • A endocitose esta ligada à exocitose dos neurotransmissores e a fusão das vesículas • Proteínas cargo  sinaptotagmina

5. Interações moleculares nas regiões de endocitose

6. Fosfoinositídeos interagem especificamente com diversas proteínas na endocitose: subunidade alfa da AP-2 dinamina AP180 epsina • Enzimas que catalizam a formação e o “turnover”de fosfoinositídeos desempenham papel importante na endocitose. • Provavelmente a nucleação da depressão revestida por clatrina é regulada por mudanças conformacionais na bicamada lipídica.

7. Endocitose mediada por clatrina: modelo 2

8. Modelo hipotético para a nucleação da depressão revestida por clatrina Embasamento teórico do modelo • As evidências mostram que sinaptotagmina e fosfoinositídeos participam na nucleação da depressão revestida por clatrina. (Particular// na terminação nervosa pré-sináptica) • AP-2 e sinaptotagmina podem ligar-se a PIP2. • Especula-se que fosfoinositídeos cooperem com a sinaptotagmina na montagem da depressão revestida. • Em relação à reciclagem da vesícula sináptica tem sido proposto que: • Fosforilação reversível de lipídeos de inositol poderia ligar as reações exocíticas e endocíticas; • Fornecer um dispositivo para conferir direcionalidade ao ciclo de vesícula sináptica.

9. Outros lipídeos da membrana (ácido fosfatídico ou colesterol) podem contribuir p/ a nucleação da depressão revestida por clatrina. (formação de “hot spots” de endocitose semelhantes a “rafts”) • Sinaptotagmina assim como sinaptofisina (outra importante proteína da membrana da vesícula sináptica), pode ligar-se ao colesterol.

10. Modelo para o recrutamento cooperativo de AP-2 à membrana pré-sináptica Interações cooperativas de fatores de membrana (sinaptotagmina e PIP2) podem converter AP-2 fraca// ligado a motivos baseados em Y da proteína transportada em Sítios de nucleação firme// ligados à membrana  permitindo Montagem da depressão revestida por clatrina • Fatores citosólicos que se ligam a PIP2 (AP180/CALM e epsina) podem também contribuir para a nucleação da depressão revestida.

11. AP-2 forte// ancorado AP-2 fraca// ancorado Membrana pré-sináptica • C2A/C2B - domínios da sinaptotagmina • Yxx - motivo endocítico baseado em Y Esquema do modelo para o recrutamento cooperativo de AP-2 à membrana pré-sináptica Fig. 2 - Possíveis interações entre fatores de membrana e AP-2 na nucleação da depressão revestida. Ocorrem Interações simultâneas entre AP-2, PIP2, sinaptotagmina e a proteína transportada.

12. “Desencapamento” da vesícula

13. “Desencapamento” da vesícula • Processo rápido: vesículas livres e revestidas de clatrina são raramente observadas nas células vivas ou estimuladas • hsc70 • ATPase pertencente à família DnaK de ptns de choque térmico de 70kDa • Desencadeia a desmontagem da cadeia de clatrina • Auxilina • Ptn acessória que contém um domínio DnaJ • Liga em AP-2 e clatrina, recrutando hsc70 • Participa na remoção de AP-2 da membrana

14. “Desencapamento” da vesícula • Estudos bioquímicos indicaram a presença de uma ptn adicional de 100kDa, ainda não caracterizada • Stoned B/Stonin 2: identificada inicialmente em drosófila • Associa-se à sinaptotagmina através de um domínio homólogo ao 2 e também se associa à AP-2 • Superexpressão inibe a endocitose mediada por clatrina, promovendo a dissociação de AP-2 da membrana plasmática

15. “Desencapamento” da vesícula • Stoned B/Stonin 2 • Domínio homólogo ao 2: compete com AP-2 na ligação à sinaptotagmina “in vitro” • Funções adicionais durante a endocitose? Seleção do cargo e modulação da montagem da cobertura de clatrina • Inositol-fosfatase sinaptojanina 1 • Camundongos deficientes: acumulam PtdIns(4,5)P2 e vesículas recobertas de clatrina 349885018472

16. Perspectivas futuras • Desenvolvimento de novas ferramentas • Acompanhar a complexa rede de interação ptn-ptn e ptn-lipídeo durante a endocitose e determinar o papel preciso de cada componente nesse processo • Uma vez revelados os fatores envolvidos, estudar como esses fatores são regulados em condições fisiológicas determinadas