ELVÁLASZTÁSTECHNIKAI MÓDSZEREK ELMÉLETE ÉS GYAKORLATA Dr. Kremmer Tibor - PowerPoint PPT Presentation

xantha-buck
slide1 n.
Skip this Video
Loading SlideShow in 5 Seconds..
ELVÁLASZTÁSTECHNIKAI MÓDSZEREK ELMÉLETE ÉS GYAKORLATA Dr. Kremmer Tibor PowerPoint Presentation
Download Presentation
ELVÁLASZTÁSTECHNIKAI MÓDSZEREK ELMÉLETE ÉS GYAKORLATA Dr. Kremmer Tibor

play fullscreen
1 / 41
Download Presentation
ELVÁLASZTÁSTECHNIKAI MÓDSZEREK ELMÉLETE ÉS GYAKORLATA Dr. Kremmer Tibor
150 Views
Download Presentation

ELVÁLASZTÁSTECHNIKAI MÓDSZEREK ELMÉLETE ÉS GYAKORLATA Dr. Kremmer Tibor

- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - E N D - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -
Presentation Transcript

  1. ELVÁLASZTÁSTECHNIKAI MÓDSZEREK ELMÉLETE ÉS GYAKORLATA Dr. Kremmer Tibor VI. FOLYADÉKKROMATOGRÁFIÁS MÓDSZEREK GÉLKROMATOGRÁFIA EÖTVÖS LORÁND TUDOMÁNY EGYETEM Budapest – 2013

  2. GÉLKROMATOGRÁFIA GEL CHROMATOGRAPHY - GEL FILTRATION MOLEKULA MÉRET SZERINTI ELVÁLASZTÁSÚ KROMATOGRÁFIA SIZE EXCLUSION CHROMATOGRAPHY SEC GÉL PERMEÁCIÓS KROMATOGRÁFIA GEL PERMEATION CHROMATOGRAPHY GPC

  3. TÖRTÉNETI ÁTTEKINTÉS McBain (1929) Molecular Sieving - Molekula sziták, zeolitok – permutitok Deuel és Neukom (1954) Desalting - Poliszacharid gélek, sómentesítés Porath és Flodin (1954) Gel Filtration - GÉLSZŰRÉS Uppsala – Pharmacia Fine Chemicals, Sephadex – Sepharose gélek Gelotte (1960), Pedersen (1962), Flodin és Porath (1961-63) Size Exclusion Chromatography (SEC) Méret szerinti kizáródásos kromatográfia Szterikus-volumetrikus térfogati megoszlási modell Steere és Ackers (1962) Restricted Diffusion Chromatography Hjerten és Mosbach (1962) Molecular Sieve Chromatography A molekula „szitálás” matematikai modellje Moore (1964) Gel Permeatíon Chromatography (GPC) Casassa (1967), Ogston (1968-70) Termodinamikai értelmezés Ozmotikus nyomás – entrópia változás alapján Determann(1964) Gel Chromatography - GÉLKROMATOGRÁFIA

  4. A GÉLKROMATOGRÁFIA ELVÁLASZTÁSI MECHANIZMUSÁNAK SZTERIKUS ELMÉLETI MODELLJE

  5. Térhálós szerkezetű polidextrán alapú xerogél (Sephadex) pásztázó elektronmikroszkópos (SEM) képe.

  6. PORÓZUS SZILIKA GÉL ELEKTRONMIKROSZKÓPOS KÉPE

  7. GÉLKROMATOGRÁFIA • AZ ELVÁLASZTANDÓ ANYAG(OK) • Kémiai tulajdonságai: • Szerkezet – stabilitás • Funkcionális csoportok • Biológiai aktivitás • Molekula méret-tömeg, eloszlás • Kis molekulák – Makromolekulák, Biopolimerek • Fizikai tulajdonságai: • Oldékonyság (poláris-apoláris) • Szolvatáció – hidratáció • Alak (globuláris - fibrilláris), konformáció – aggregáció • Hidrodinamikai jellemzők • Stokes-f rádiusz, diffúziós állandó, • belső viszkozitás, flexibilitás

  8. GÉLKROMATOGRÁFIA AZ ÁRAMLÓ FÁZIS AZ ELUENS – OLDÓSZER POLARITÁSA pH, IONERŐSSÉG, ION MINŐSÉG VISZKOZITÁS (KONCENTRÁCIÓ) ADALÉKOK detergensek, stabilizálók, antioxidánsok, antibakteriális vegyületek, stb,

  9. GÉLKROMATOGRÁFIA • AZ ÁLLÓ (GÉL) FÁZIS • A TÖLTET KÉMIAI ÖSSZETÉTELE - SZERKEZETE • Xerogel - liogel, térhálós polimerek, Biokompatibilitás, • SZERVETLEN OXIDOK • SiO2, Al203, hidroxi apatit, TiO2, üvegszemcsék (CPG), • SZERVES POLIMEREK • Dextrán, agaróz, akrilamid, akril-metakrilát, poliéter- észter, polivinilalkohol, polisztirol-divinilbenzol, • KEVERT TÍPUSOK • Szervetlen-szerves - Si02- poliszacharid, • Szerves-szerves – dextrán - agaróz, • Egyéb polimerek - akrilamid - PS-DVB

  10. AGARÓZ GÉL SZERKEZETE (Araki, 1956)

  11. TÉRHÁLÓS DEXTRÁN GÉLEK (Sephadex) SZERKEZETE

  12. N,N’-METILÉN BIS-AKRILAMIDDAL TÉRHÁLÓSÍTOTT POLIAKRILAMID GÉLEK

  13. GFC - SEC POLÁRIS – HIDROFIL GÉLKROMATOGRÁFIÁS TÖLTETEK

  14. GPC – SEC APOLÁRIS – HIDROFÓB/ORGANOFIL GÉLKROMATOGRÁFIÁS TÖLTETEK

  15. Kereskedelmi HPLC-SEC oszloptöltetek Nanorészecskék, makromolekulák, biopolimerek elválasztására

  16. A száraz (xerogél) szemcsék mérete (μm) fajtától függően: • durva (coarse) 100-300, közepes (medium) 50-150, • finom (fine) 20-80, vagy szuperfinom (superfine) 10-40 lehet.

  17. HOMODISZPERZ SZTIROL-DIVINIL BENZOL KOPOLIMER SZEMCSÉK (BioBeads, 5 m) SEM KÉPE

  18. HOMODISZPERZ SZFEROID SZEMCSÉK TÉRBELI ILLESZKEDÉSÉNEK HEURISZTIKUS MODELLEZÉSE

  19. HOMODISZPERZ SZFEROID SZEMCSÉK 6 ÉS 8 KOORDINÁCIÓS SZÁMMAL ILLESZKEDŐ TÉRBELI MODELLJEI

  20. A GÉLKROMATOGRÁFIA SZTERIKUS-VOLUMETRIKUS EGYENLETE

  21. AZ ÁLLÓ (GÉL) FÁZIS SZERKEZETE A GÉLEK SZÁRAZANYAG (TÉRHÁLÓ) TARTALMA (súly %) Agaróz 0.3 – 1.5 Sephadex 3 - 30 Poliakrilamid 2.5 - 15 A gélszemcsék 70 – 95 %-a víz (oldószer) ! ERŐSEN HIDRATÁLT (SZOLVATÁLT) SZERKEZET A víz (oldószer) molekulák (dinamikus egyensúlyban) a térhálóhoz rögzített térszerkezetet képeznek. A rögzített folyadéktér hozzáférhetőségét a térhálós szerkezet sűrűsége (keresztkötések száma, orientációja, „pórusméret”) és az oldott (elválasztandó) molekula mérete (tömege) határozza meg.

  22. Az elválasztás technika szemlélete szerint a GÉLKROMATOGRÁFIA aFOLYADÉK-FOLYADÉKMEGOSZLÁSI KROMATOGRÁFIA SPECIÁLIS HATÁRESETE ahol azállóés azáramlófázisugyanaz az oldószer, a szerkezetileg rögzített és a folyadék halmazállapotú vízmolekulák. Az ELVÁLASZTÁS MECHANIZMUSA a fázisok közötti térfogati megoszlás (fázisarány, megoszlási együttható) a molekula méretének (tömegének) függvénye. Kav ~ f(log M) (A molekula rendelkezésére álló tér(fogat), „oldékonysága” különböző a két fázisban)

  23. Ve Vo BIOPOLIMEREK MOLEKULA TÖMEGÉNEK (MÉRETÉNEK) MEGHATÁROZÁSA GÉLKROMATOGRÁFIÁVAL log M  Ve / V0 = Kav (Vt – V0) (Vt – V0) állandó érték  2/3 . Vt Kav = 0 – 1 log M  Kav Determann egyenletek (1966-69) Dextrán (Sephadex) gélekre - fehérjékre, enzimekre logM = M0 - (6.06-5.00 )  = a xerogél szemcse sűrűsége

  24. MOLEKULA TÖMEG (MÉRET) MEGHATÁROZÁSA GÉLKROMATOGRÁFIÁVAL

  25. A gélkromatográfia térfogati paramétereinek összefüggése a diffúziós állandóval

  26. A MOLEKULA TÖMEGÉNEK ÉS MÉRETÉNEK ÖSSZEFÜGGÉSE A gélkromatográfia alkalmazására vonatkozóan hangsúlyozni kell a molekula tömegének és (virtuális) méretének összefüggését (eltérését), amely a molekula fajlagos parciális térfogatával és a Stokes-féle rádiusszal írható le: M – molekulatömeg, N – Avogadro-féle szám, a– Stokes-féle rádiusz, D–diffuziós állandó, υ– molekula fajlagos parciális térfogata, η– viszkozitási együttható.

  27. A GÉLKROMATOGRÁFIA MÓDSZEREI ÉS ALKALMAZÁSI TERÜLETEI PREPARATÍV (BATCH) MINTA ELŐKÉSZÍTÉS - ANALITIKAI OSZLOPKROMATOGRÁFIA (LC – HPLC) - RÉTEGKROMATOGRÁFIA BEKONCENTRÁLÁS SÓMENTESÍTÉS PUFFER CSERE CSOPORT FRAKCIONÁLÁS TISZTÍTÁS – ELVÁLASZTÁS MOLEKULA TÖMEG (MÉRET) MEGHATÁROZÁS DETERGENS GÉLKROMATOGRÁFIA KROMATOFOKUSZÁLÁS

  28. MOLEKULA TÖMEG MEGHATÁROZÁS GÉLKROMATOGRÁFIÁVAL

  29. CSOPORT FRAKCIONÁLÁS GÉLKROMATOGRÁFIÁVAL

  30. POLIETILÉNEK (2-32 kDa) ÉS SZÉNHIDROGÉNEK (C5-C58) ELVÁLASZTÁSA MÉRET SZERINTI KIZÁRÓDÁSOS (SEC) GÉLKROMATOGRÁFIÁVAL

  31. TRANSZFERRIN TISZTÍTÁSA GÉLKROMATOGRÁFIÁVAL

  32. HUMÁN SZÉRUM LIPO PROTEIN OSZTÁLYOK (SEM) CHYLOMICRON VLDL

  33. A HUMÁN SZÉRUM LOW DENSITY LIPOPROTEIN (LDL) MOLEKULA DODEKAHEDRÁLIS (pentagon dodekaéder) MODELLJE

  34. HUMÁN SZÉRUM LIPOPROTEIN OSZTÁLYOK ELOSZLÁSA ELFO VLDL LDL HDL UC

  35. HUMÁN SZÉRUM LIPOPROTEINEK ELVÁLASZTÁSA ELEKTROFORÉZISSEL AGARÓZ GÉLEN

  36. LDL HUMÁN SZÉRUM LIPOPROTEINEK SEC ELVÁLASZTÁSA AGARÓZ (Sepharose 6B) GÉLOSZLOPON VLDL HDL

  37. PLAZMA MEMBRÁN ÖSSZETEVŐK SZOLUBILIZÁLÁSA DETERGENSEKKEL (SDS - Na-dodecil szulfát) SDS (900 – 5 min) Detergens Sejtmembrán Fehérje és lipid micellák

  38. - o - - X - - ● - Májsejtek plazma membrán fehérje és lipid tartalmának elválasztása detergens gélkromatográfiával Sepharose 4B oszlopon.