Computerkurs: Quantitative Auswertung biochemischer Experimente

1. Computerkurs: Quantitative Auswertung biochemischer Experimente Guten Morgen Computerkurs: Quantitative Auswertung biochemischer Experimente

2. Computerkurs: Quantitative Auswertung biochemischer Experimente: Tag 2 • Auswertung von Michaelis-Menten Kinetiken • Aufgabe 4: Michaelis-Menten Kinetiken I • Einführung in die Auswertung von Dissoziationskinetiken • Aufgabe 5: Auswertung von Dissoziationskinetiken Computerkurs: Quantitative Auswertung biochemischer Experimente

3. Computerkurs: Quantitative Auswertung biochemischer Experimente Schnell ! Computerkurs: Quantitative Auswertung biochemischer Experimente

4. Anpassung • Wähle Modell • Definiere Parameter • Berechne theoretische Daten (mit willkürlichen Startwerten für alle Parametern). • Berechne Abweichung zwischen den theoretischen Daten und den gemessenen Daten: • Minimiere FQS durch Variation der Parameter. • Ergebnis • Kombination an Zahlenwerten für alle Parameter, welche die gemessenen Daten am besten beschreibt Computerkurs: Quantitative Auswertung biochemischer Experimente

5. Warum Fehlerquadrate? • Große Abweichungen werden stärker gewichtet • gerechtfertigt bei normalverteilten Daten • Dann gilt (d.h. die Häufigkeit von Abweichungen sinkt mit dem Quadrat der Abweichung) Computerkurs: Quantitative Auswertung biochemischer Experimente

6. Minimum der FQS 1. Parameter 2. Parameter Suche nach Minimum der FQS im N-dimensionalen Fehlerraum Computerkurs: Quantitative Auswertung biochemischer Experimente

7. Wie funktioniert nicht-lineare Regression? • Programm berechnet die Steigung der Fehlerfläche, bei den Startbedingungen. • Variablen werden einen Schritt in Richtung des Minimums verändert. • Programm berechnet am Zielpunkt erneut die Steigung der Fehlerfläche und verändert die Variablen erneut. • u.s.w. • Kritische Parameter • Schrittweite • Intensität des Absuchens der Fehlerfläche Computerkurs: Quantitative Auswertung biochemischer Experimente

8. mögliche Komplikation: schlechte Startwerte Minimum der FQS mögliche Komplikation: Nebenminima 1. Parameter 2. Parameter Computerkurs: Quantitative Auswertung biochemischer Experimente Suche nach Minimum der FQS im N-dimensionalen Fehlerraum. Anpassungen (besonders komplexe) sollten mit verschiedenen Startwerten mehrmals durchgeführt werden Computerkurs: Quantitative Auswertung biochemischer Experimente

9. Anforderungen an Auswertungsmethoden • optische Kontrolle (alle Auswertung müssen mit Grafiken auf ihren “Sinngehalt” und ihre Genauigkeit hin überprüft werden) • kein Datenverlust (es dürfen bei Manipulationen niemals die Originaldaten verloren gehen) • keine unübersichtliche Fehlerfortpflanzung (möglichst keine Anwendung von 1/x, yx o.ä. auf die Daten) Computerkurs: Quantitative Auswertung biochemischer Experimente

10. Auswertung von Michaelis-Menten Kinetiken Funktion „veraltete“ Auswertung: Linearisierung (z.B. Lineweaver-Burk) y = a+bx Computerkurs: Quantitative Auswertung biochemischer Experimente

11. Dieser Punkt ist am ungenauesten, beeinflusst das Ergebnis der linearen Regression aber sehr stark. Probleme bei der Linearisierung von Daten Lineare Regression setzt voraus, daß alle Datenpunkte dieselbe Standardabweichung haben. Dies gilt nach Datentransformationen nicht mehr. 1 5 4 0,8 3 0,6 1/k k 2 0,4 1 0,2 0 0 0 1 2 3 0 2 4 6 1/c c S S Fehler in direkter Auftragung Fehler in LB-Auftragung Computerkurs: Quantitative Auswertung biochemischer Experimente

12. Nicht-lineare Anpassung • Wähle Modell: • Parameter: • Berechne theoretische Daten • Berechne Abweichung zwischen den theoretischen Daten und den gemessenen Daten: • Minimiere FQS durch Variation der Parameter. • Ergebnis: die Kombination an Zahlenwerten für Km und kcat, welche die gemessenen Daten am besten beschreibt. Michaelis-Menten Kinetik Km, kcat Computerkurs: Quantitative Auswertung biochemischer Experimente

13. K [µM] 1,09 m k [1/min] 0,90 cat 0,8 0,7 0,00014773 c(S) [µM] k [1/min] k, theo FQ 0,6 0 0 0,5 k [1/min] 0,1 0,08 0,07587551 9,9744E-07 0,4 k, theo 0,5 0,28 0,28397196 1,5598E-05 0,3 1 0,43 0,43211041 1,1484E-05 0,2 2 0,59 0,58459097 9,9564E-05 0,1 5 0,74 0,74160738 2,0084E-05 0 0 2 4 6 Auswertung von Michaelis-Menten Kinetiken • keine Datentransformation • keine Verfälschung der Fehlerbereiche • Genauigkeit der Messung und Auswertung direkt ablesbar Computerkurs: Quantitative Auswertung biochemischer Experimente

14. Behandlung von Ausreißern Computerkurs: Quantitative Auswertung biochemischer Experimente

15. Identifizierung von Ausreißern • Ausreißer sind einzelne Werte, die nicht zu den anderen gemessenen Daten passen • Wurde der Wert korrekt eingegeben? • Werte, bei denen man eine Idee hat, was experimentell falsch gelaufen ist • Gibt es andere Gründe (biologische Diversität)? Computerkurs: Quantitative Auswertung biochemischer Experimente

16. Behandlung von Ausreißern • Zufall – Messwerte haben ein Verteilung • Der Ausreißer muss mit berücksichtigt werden • Fehler – Pipettierfehler etc. • Der Ausreißer darf nicht berücksichtig werden • Wie unterscheide ich zwischen beiden Fällen? • Statistik (benötige aber viele Daten !) Computerkurs: Quantitative Auswertung biochemischer Experimente

17. aber: Modell falsch ! „Die Natur macht keine Sprünge.“ Behandlung von Ausreißern Beispiele Computerkurs: Quantitative Auswertung biochemischer Experimente

18. aber: Verbesserte Methode kann evtl. ganze Kurve beschreiben Mit LR darf nur Anfangsphase der Reaktion ausgewertet werden Behandlung von Ausreißern Beispiele Computerkurs: Quantitative Auswertung biochemischer Experimente

19. Alle Daten wurden einer Gaussverteilung mit Mittelwert 100 und einer Standardabweichung von 100 entnommen Behandlung von Ausreißern Aus :http://www.graphpad.com/manuals/Prism4/RegressionBook.pdf Ausreißer ??? Vorsicht, wenn Messpunkte offensichtlich wie Ausreißer aussehen! Computerkurs: Quantitative Auswertung biochemischer Experimente

20. Einführung in die Fehleranalytik • Sinnvolle Fehlerabschätzungen gehören zu den schwierigeren Aufgaben im wissenschaftlichen Alltagsbetrieb. Typische Fragestellungen sind: • Wie zuverlässig sind meine Daten? • Wie genau sind die berechneten Konstanten? • Kann ich bestimmte Modelle ausschließen? Computerkurs: Quantitative Auswertung biochemischer Experimente

21. B ist größer als A 16,0 15,4 Computerkurs: Quantitative Auswertung biochemischer Experimente Messung A Messung B 12 14 21 17 16 13 15 23 17 9 Mittelwert µ 3,4 5,2 Standardabw. s Computerkurs: Quantitative Auswertung biochemischer Experimente

22. Analyse der Genauigkeit einzelner Messungen„Jacknife“-Test • Einzelne Punkte werden zufällig aus der Anpassung herausgenommen. • Damit “simuliert” man, was man auswerten würde, wenn man diese Experimente nicht gemacht hätte. • Man erhält, wenn man genug Daten hat, eine Verteilung von Parametern mit Mittelwert und Standardabweichung • Eine solche Analyse sollte ein Routinebestandteil jeder Auswertung jedes Experimentes sein. • Gute Methode, um Unsicherheit der Datenanalyse aufzudecken. Experimentelle Fehler werden nicht erfasst! Computerkurs: Quantitative Auswertung biochemischer Experimente

23. Auswertung von Dissoziationskinetiken AB  A +B Computerkurs: Quantitative Auswertung biochemischer Experimente

24. -1 k [min ] 0,11 -1 f 635,4387239 null 37,53531338 800 19353,0478 600 t [min] Signal theo FQ 0,25 705,6939205 655,894892 2479,94322 CPM 400 0,5 710,8760626 639,274796 5126,7414 1 510,5366268 607,362727 9375,29374 200 2 504,8990776 548,526019 1903,30999 4 460,8060893 448,450625 152,657509 0 8 306,0654934 303,259429 7,87399714 0 20 40 60 80 15 148,2074542 161,448807 175,333426 t [min] 30 64,94754309 61,6990184 10,5529123 60 49,46970057 38,4541819 121,341651 Auswertung von Dissoziationskinetiken Modell: Lösung: Computerkurs: Quantitative Auswertung biochemischer Experimente

25. Computerkurs: Quantitative Auswertung biochemischer Experimente • Auswertung von Michaelis-Menten Kinetiken • Aufgabe 4: Michaelis-Menten Kinetiken I • Einführung in die Auswertung von Dissoziationskinetiken • Aufgabe 5: Auswertung von Dissoziationskinetiken Computerkurs: Quantitative Auswertung biochemischer Experimente