Alternatywny splicing

1. Alternatywny splicing Wyjątek, który może być regułą? Kamil Lipiński

2. Splicing jako potranskrypcyjna modyfikacja mRNA Splicing konstytutywny (‘constitutive’)* Splicing alternatywny (‘alternative’) Izoformy *W ‘Molecular Biology of the Gene’ w ramach splicingu alternatywnego wyróżnia się alternatywny splicing regulacyjny oraz konstytutywny, co ma zupełnie inne znaczenie. W tej samej publikacji podzielono jednocześnie cały splicing na konstytutywny i alternatywny, analogicznie jak w powyższy schematach. Schematy: „Genoms” T. A. Brown, 2001

3. Sekwencja intronu a splicing Sekwencje konserwatywne w intronach kręgowców Conajmniej 15%, a być może nawet do 50% ludzkich chorób genetycznych powstaje na skutek mutacji albo w miejscach splicingowych albo w innych elementach warunkujących poprawnych splicing* Ogólny schemat składania mRNA *Understanding alternative splicing: towards a cellular code, Nature reviews: 2005 „Genoms” T. A. Brown

4. Spliceosom - rola snRNP Rozpoznanie miejsc cięcia i składania zachodzi na zasadzie hybrydyzacji snRNA z sekwencjami konserwatywnymi w intronach. Motywy te mogą znajdować się wewnątrz eksonu czy intronu przypadkowo (miejsca kryptyczne). Musi zatem istnieć mechanizm zapewniający ich ignorowanie. „Biochemia” Streyer, 2005

5. Sekwence konserwatywne w intronach Sekwencje posiłkowe (‘auxiliary elements’) Trakt polipirymidynowy (PPT) Miejsca donorowe Represory splicingu Miejsca akceptorowe Miejsca rozgałęzienia Aktywatory splicingu Mechanizm wyboru miejsc cięciai składania Elementy ‘cis-acting’ Elementy ‘trans-acting’ snRNP spliceosomu Silencery Czynniki splicingowe Enhancery Schemat: projekt własny, na podstawie danych z różnych pozycji w bibliografii

6. Mechanizm wyboru miejsc cięcia i składania Rekrutacja białek regulacyjnych (czynników splicingowych) na pre-mRNA wpływa na rozpoznawanie miejsc cięcia i składania mRNA przez snRNP spliceosomu. Sekwencje rozpoznawane przez czynniki splicingowe: • ESE – ‘exonic splicing enhancer’ • ISE – ‘intronic splicing enhancer’ • ESS – ‘exonic splicing silencer’ • ISS – ‘intronic splicing silencer’ „Protein Diversity from Alternative Splicing. A Challenge for Bioinformatics and Post-Genome Biology” Douglas L. Black, Cell 103:368, 2000

7. Rola czynników splicingowych Rekrutacja białek regulacyjnych (czynników splicingowych) na pre-mRNA wpływa na rozpoznawanie miejsc cięcia i składania mRNA przez snRNP spliceosomu. Białka z rodziny SR i hnRNP PTB / hnRNPI RRM3 i 4 rozpoznaje CUCUCU* *RRM – „RNA Recognition Motif” Schemat: http://www.mimg.ucla.edu, http://www.library.csi.cuny.edu

8. Mechanizmy aktywacji i represji PTB wypętla ekson N1 w ssaczym genie src, co powoduje jego pominięcie Z pre-mRNA genu tat wirusa HIV1 powstają dwa warianty mRNA. Proporcja zależy od względnej ilości/aktywności hnRNPA1 i SF2/ASF Schemat: na podstawie „Understanding alternative splicing (…)”, Nature reviews, 2005

9. Poziomyzjawiska Poprzez alternatywny splicing z jednego pre-mRNA danego genu powstają różne warianty mRNA (zazwyczaj więc różne izoformy białek): • w jednym rodzaju komórek: • - gen receptora DSCAM Drosophila • - antygeny t/T wirusa SV40 • w komórkach różnego rodzaju (tkanki): • gen α-tropomiozyny szczura • src ssaków • w komórkach różnych osobników tego samego gatunku: • - sxl, tra, tra-2, dsx - determinacja płci u Drosophilamelanogaster

10. Klasyfikacja • Pominięcie eksonu (‘exon skipping’) • - sxl, dsx Drosophila • - gen α-tropomiozyny szczura • - src ssaków • Zatrzymanie intronu (‘intron retention’) • Alternatywne 5’końcowe miejsce • Alternatywne 3’końcowe miejsce • - traDrosophila • - gen antygenu T/t SV40 • Wybór jednego z eksonów • -gen receptora DSCAM Drosophila Schemat: http://www.stanford.edu

11. AS w genie antygenu T/t wirusa SV40 Splicing antygenu T/t wirusa SV40 Zidentyfikowany czynnik splicingowy, odpowiedzialny za wybór 5’ miejsca, nazwano ASF (‘alternative splicing factor’). Czynnik ten okazał się być tym samym, co SF2 - czynnikiem biorącym udział we wczesnym etapie asocjacji spliceosomu na wielu różnych pre-mRNA różnych genów. Przykład wyboru alternatywnego 5’ miejsca do wspólnego 3’ miejsca ASF/SF2 jest białkiem z rodziny SR. Zwiększona koncentracja promuje wybór 5’ miejsca najbliższego do 3’ miejsca. Obie izoformy powstają w zakażonej komórce w określonej proporcji. Schemat: na podstawie „Genes VIII”, Benjamin Levin, 2004

12. AS α-tropomiozyny szczura Izoformy tropomiozyny powstają w wyniku pomijania eksonów (‘exon skipping’) Izoforma białka powstającego w wyniku ekspresji genu zależy od rodzaju komórki, a więc w różnych tkankach powstają różne warianty mRNA. Oznacza to, że mechanizm regulujący alternatywny splicing tego genu jest tkankowo specyficzny. Schemat: http://www.oregonstate.edu

13. AS genu DSCAM Drosophila • Każdy mRNA będzie zawierał jedną z: • 12 możliwych alternatyw dla eksonu 4 (czerwony) • 48 możliwych alternatyw dla eksonu 8 (niebieski) • 33 możliwych alternatyw dla eksonu 9 (zielony) • 2 możliwych alternatyw dla eksonu 17 (żółty) W efekcie daje to możliwości powstania 38,016 różnych mRNA i białek „Protein Diversity from Alternative Splicing. A Challenge for Bioinformatics and Post-Genome Biology” Douglas L. Black, Cell 103:368, 2000

14. AS w determinacji płci somatycznej Drosophila Specyficzne dla płci alternatywne wycinanie intronów z pre-mRNA sxl Gen podlega samoregulacji: wczesne białko SXL powoduje pominięcie eksonu 3 w mRNA późnego białka SXL (prowadzi do represji splicingu) sxl – (‘sex lethal’) nadzędny gen regulatorowy somatycznej determinacji płci Schemat: projekt własny, na podstawie danych z różnych pozycji w bibliografii

15. AS w determinacji płci somatycznej Drosophila SXL promuje wybór kryptycznego 3’ miejsca splicingu wewnątrz eksonu 2. TRA powoduje pominięcie eksonu 4 w mRNA dsx, zawierającego kodon stop. Zarówno krótsza jak i dłuższa izoforma DSX jest funkcjonalna. DSX(F) i DSX(M) są regulatorami transkrypcji genów wykonawczych Schemat: projekt własny, na podstawie danych z różnych pozycji w bibliografii

16. Bibliografia • „Genetyka molekularna” , praca zbiorowa pod redakcją Piotra Węgleńskiego, Wydawnictwo Naukowe PWN, Warszawa 2006 • „Genomy”, T. A. Brown, przekład pod redakcją Piotra Węgleńskiego, Wydawnictwo Naukowe PWN, Warszawa 2001 • „Protein Diversity from Alternative Splicing. A Challenge for Bioinformatics and Post-Genome Biology”, Douglas L. Black, Cell 103:368, 2000 • „Molecular Biology of the Gene, fifth edition”, James D. Watson et al.., 2004 • „Genes VIII”, Benjamin Lewin, 2004 • Understanding alternative splicing: towards a cellular code”, Arianne J. Martiln, Francis Clark, Christopher W. J. Smith, Nature reviews: 2005 • „Splicing in action: assessing disease causing sequence changes”, D. Baralle, M. Baralle, JMG Online, 2005 • „Function of alternative splicing”, Stefan Stamm et al.., Science Direct, 2005 • „Mechanisms of alternative pre-messenger RNA splicing”, Douglas L. Black, Annual Review of Biochemistry, 2003

17. BIAŁKA ‘KOMBINOWANE’ (IZOFORMY) GENEROWANIE ZŁOŻONYCH PROTEOMÓW SEKWENCJA ORF „CELLULAR CODE” ALTERNATYWNY SPLICING ELASTYCZNE i SELEKTYWNE ‘ŁĄCZENIE’ SEKWENCJI TKANKOWO SPECYFICZNA REGULACJA EKSPRESJI INNE MODYFIKACJE ZMIANY O CHARAKTERZE REGULACYJNYM REGULACJA EKSPRESJI NONSENSE-MEDIATED DECAY RUST

18. Pre-mRNA intron 5’ 3’ ekson 1 ekson 2 miejsce donorowe 5’-GU-3’ miejsce rozgałęzienia 5’-A-3’ trakt pirymidyn 5’-YYYYYY-3’ miejsce akceptorowe 5’-AG-3’

19. mRNA 2 ekson 1 ekson 3 Intron 1 Intron 2 5’ 3’ ekson 1 ekson 2 ekson 3 mRNA 1 ekson 1 ekson 2 ekson 3 Negatywny czynnik splicingowy (represor splicingu) np. Sxl, PTB Pozytywny czynnik splicingowy (aktywator splicingu) np. białka SR snRNP spliceosomu np. U1 snRNP