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第三节 常用定量分析方法及其运用 药学 0201 王欢欢 3021901012

第三节 常用定量分析方法及其运用 药学 0201 王欢欢 3021901012. 生化药物、基因工程药物常用定量分析方法. 理化分析法 化学分析法 电化学分析法 光谱分析法 色谱法 生化测定法 酶法 电泳法 生物检定法. 化学分析法. 重量法 根据样品中分离出的单质或化合物的重量测定所含成分的含量 根据被测组分分离方法分类 ： 提取法 胰酶中脂肪含量的测定 挥发法 炽灼残渣 干燥失重 沉淀法 沉淀反应 滴定分析法

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第三节 常用定量分析方法及其运用 药学 0201 王欢欢 3021901012

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  1. 第三节 常用定量分析方法及其运用 药学0201 王欢欢 3021901012

  2. 生化药物、基因工程药物常用定量分析方法 理化分析法 化学分析法 电化学分析法 光谱分析法 色谱法 生化测定法 酶法 电泳法 生物检定法

  3. 化学分析法 • 重量法 根据样品中分离出的单质或化合物的重量测定所含成分的含量 根据被测组分分离方法分类： 提取法 胰酶中脂肪含量的测定 挥发法 炽灼残渣 干燥失重 沉淀法 沉淀反应 • 滴定分析法 根据样品中某些成分与标准溶液能定量地发生酸碱中和、氧化还原或络合反应等进行测定

  4. 电化学分析法 离子选择性电极 药物电极 酶电极 药物膜电极 酶催化反应 生物组织膜电极 生成产物不 微生物电极 同，电极种 免疫电极 类不同 免疫场效应管 其他：极谱氧电极法 微电流电位法 生物传感器技术

  5. 光谱分析法 • 比色法 蛋白质 双缩脲反应 硫酸软骨素 Elson-Morgan比色法 按干燥品计算，测定氨基己糖含量 原理：酸性条件下水解 氨基己糖 碱性条件下与乙酰丙酮反应 再与二甲氨基苯甲醛反应 氨基葡萄糖（红色） 以盐酸葡萄糖溶液为对照，525nm测定A

  6. A×Ws×0.8309×500 氨基己糖的含量= ×100％ As×W 计算: 式中 A—供试品溶液吸收度平均值 As—对照品溶液吸收度平均值 Ws—对照品溶液每1ml中含盐酸氨基葡萄 糖的量（mg） 0.8309—校正因数（氨基葡萄糖与盐酸氨 基葡萄糖分子量的比值）

  7. 紫外分光光度法 蛋白质 280nm 糜蛋白酶与底物N-乙酰-L-酪氨酸乙酯作用后产物 237nm • 荧光分光光度法 反应物或反应激发产生荧光直接测定 应用荧光试剂的荧光测定 应用另一酶的催化反应的荧光测定

  8. 酶法 酶活力测定法 酶分析法 以酶为分析对象 以酶为分析工具或试剂 活力单位 比活性 酶以外其它物质的含量 共同点： 以酶能专一而高效地催化某些反应为基础，通过对酶反应或生成物等浓度的测定而检测相应物质的含量

  9. 酶活力测定法 • 基本概念 酶活力 酶催化一定化学反应的能力 活性单位（国际单位，IU） 任何一种酶，在25℃以最适当的底物浓度、 最适当的缓冲离子强度以及最适当的pH等 条件下，每分钟能转化一微摩尔底物的酶量 比活性 每一毫克蛋白质所含酶的单位数 分子活力 每微摩尔酶对最适底物的活性单位 每个酶分子每分钟转化底物的分子量

  10. 测定方法 • 物理法 化学法 酶分析法 • 终点法 动力学法（取样测定法） 反应速率法（连续测定法）

  11. 取样测定法 中止酶反应 酶变性剂 5%三氯醋酸3%高氯酸酸碱醇 • 连续测定法 在反应过程中对反应系统进行连续检测 准确性和测定效率都较取样法更好

  12. 检测方法 紫外－可见分光光度法 氧化还原酶 脱氢辅酶NAD(P)H 340nm 细胞色素氧化酶底物细胞色素C 550nm 摩尔吸收系数 2.18×104 氧化型 0.80×104 荧光分光光度法 底物本身在酶反应过程中有荧光变化 利用具有荧光底物 旋光度法 酶偶联测定法 其他 电化学测定法 离子选择性电极测定法 放射化学法

  13. 举例胰蛋白酶效价测定 胰蛋白酶能专一地作用于赖氨酸、精氨酸等碱性氨基酸的羧基组成的肽键，酰氨键及酯键 供试品溶液的配制 精密称取本品适量 0.001mol/L盐酸溶液溶解 制成50-60IU/ml胰蛋白酶溶液

  14. 底物溶液的配制 BAEE盐酸盐85.7mg 加水溶解使成100ml 精密量取10ml 磷酸缓冲液稀释成100ml 25.0± 0.5 ℃,253nm以水做空白，测定吸光度 A应在0.575－0.585之间为宜

  15. 测定 空白： 底物溶液3.0ml＋0.001mol/L盐酸液0.2ml 供试品溶液 0.2ml与底物溶液3.0ml 立即计时并摇匀 253nm测定吸收度 每隔30s测一次，共5min 以A为纵坐标，时间为横坐标作图 每30s吸收度改变恒定在0.015－0.018之间，呈线性关系不少于3min

  16. A1-A2 P= 0.003TW 计算 式中P－每1mg胰蛋白酶供试液中含胰蛋白酶 单位数 A1－直线上终止的吸收度 A2－直线上开始的吸收度 T－A1至A2读数的时间（min） W－测定液中含供试品的mg数 0.003－上述条件下，吸收度每改变0.003， 相当于1个胰蛋白酶单位

  17. 影响效价测定的因素 酶浓度 最佳浓度 50IU/ml－60IU/ml 温度 温度每升高1 ℃ 活力单位增高5% 底物 底物溶液应在配制后3h内使用 关键在于判断底物浓度[S]与Km的关系 pH值H+能改变酶活性中心的解离状况， 升高或降低酶的活性 空白和对照实验

  18. 酶反应进程曲线和酶浓度曲线

  19. 酶分析法 • 动力学分析法 酶的底物 当底物浓度[S]<Km时，一级反应性态 辅酶 双底物反应 一类底物浓度足够高 单底物反应 活化剂 注意：浓度超过一定水平后导致抑制 测定不专一，易受干扰 抑制剂 不可逆抑制剂 浓度 抑制程度 线性 可逆抑制剂 低浓度范围 浓度 抑制程度

  20. 举例 抑肽酶的效价测定 底物溶液的制备 N-苯甲酰-L-精氨酸乙酯盐酸盐171.3mg 加水溶解并稀释至25ml 胰蛋白酶溶液的制备 胰蛋白酶对照品适量，精密称定 加盐酸滴定液（0.001 mol/L）制成每1ml 中约含0.8单位溶液（约每1ml中含1mg） 的溶液

  21. 胰蛋白酶稀释溶液的制备 精密量取上述胰蛋白酶溶液1ml 用硼砂-氯化钙缓冲液（pH8.0）稀释成20ml 室温放置10分钟，置冰浴中 供试品溶液的制备 精密称取本品适量 加硼砂-氯化钙缓冲液制成每1ml中约含1.67单 位（约每1ml中含0.6mg）的溶液 精密量取0.5ml与胰蛋白酶溶液2ml 再用硼砂-氯化钙缓冲液（pH8.0）稀释成20ml 反应10分钟，置冰浴中（2小时内使用）

  22. 测定 供试品 硼砂-氯化钙缓冲液9.0ml＋底物溶液1.0ml 25℃±0.5℃水浴3～5分钟 滴加氢氧化钠滴定液（0.1mol/L）调节pH8.0 精密加入供试品溶液1ml 用1ml微量滴定管以氢氧化钠滴定液滴定 使溶液的pH值始终维持在7.9～8.1 每隔60秒读取pH值恰为8.0 时所消耗的氢氧化 钠滴定液的容积（ml），共6分钟 对照品 精密量取胰蛋白酶稀释液1ml，按上法操作

  23. (2n1－n2)×4000×f 每1mg 抑肽酶的效价＝ Ｗ 式中 4000为系数 Ｗ为抑肽酶制成每1ml中约含1.67单位时的酶量 n1为对照测定时每秒消耗的NaOH滴定液容积 n2为供试品溶液每秒消耗NaOH滴定液容积 2为供试品溶液中所加入胰蛋白酶的量为对照 测定时的2倍 f为氢氧化钠滴定液（0.1mol/L）校正因子 计算

  24. 总变量分析法 又称平衡法或终点法 重要条件： 被测底物浓度小，控制反应于一级反应 水平 双底物反应一底物应具有足够高的浓度 酶的用量高，以保证反应较快达到终点 酶用量，工具酶一般1Km－2Km左右

  25. 谢谢大家！

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