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SHOCK & SIGNAL TRANSDUCTION

SHOCK & SIGNAL TRANSDUCTION. YONG JIANG Key Laboratory of Proteomics of Guangdong Province, Southern Medical University. 炎症（ inflammation ） 是高等动物对损伤性刺激的一种防御反应 。 是伴随多种疾病或病理过程的一种共有的病理现象，涉及感染、创伤、高温、辐射损伤、动脉粥样硬化、缺血 / 再灌流、休克、自身免疫性疾病、支气管哮喘、糖尿病、老年性痴呆（ Alzheimer's disease ）等。

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SHOCK & SIGNAL TRANSDUCTION

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Presentation Transcript

  1. SHOCK & SIGNAL TRANSDUCTION YONG JIANG Key Laboratory of Proteomics of Guangdong Province, Southern Medical University

  2. 炎症（inflammation）是高等动物对损伤性刺激的一种防御反应。是伴随多种疾病或病理过程的一种共有的病理现象，涉及感染、创伤、高温、辐射损伤、动脉粥样硬化、缺血/再灌流、休克、自身免疫性疾病、支气管哮喘、糖尿病、老年性痴呆（Alzheimer's disease）等。 • 早在1世纪，Celsius总结出炎症反应的共同特征： • 红(Rubor)---Redness • 肿(Tumor)---Swelling • 热(Calor)---Heat • 痛(Dolor)---Pain • 功能丧失(Functio laesa)---Loss of function

  3. 炎症反应研究取得的重要进展: • 微循环在炎症反应中的作用； • 细胞因子（cytokines）的生成和调控作用； • 补体（complement）和激肽（kinin）的激活和作用； • 白细胞的激活和趋化因子（chemokine）的反应； • 白细胞和内皮细胞粘附分子（adhesion molecules）的鉴定和功能研究； • 前列腺素（prostaglandins）和白三烯（leukotrienes）生成机制的研究; • NSAIDs（nonsteroidal anti-inflammatory drugs）的合成和临床应用； • NO（nitricoxide）调节血管紧张性的发现及其机制的研究； • 炎症反应的免疫调控，如抗原呈递（antigen presentation）

  4. 致炎刺激（proinflammatory stimuli） 细胞内信号转导系统 细胞炎症反应 炎症反应研究的焦点问题:

  5. MAPK—哺乳动物细胞功能调控的重要信号系统: • 1991年：首先在哺乳动物细胞鉴定出ERK (extracellular-signal regulated protein kinase)。 • 1993年：JNK(c-Jun amino-terminal kinase)/SAPK（stress-activated protein kinase） • 1994年：p38/RK/CSBP • 1995年：ERK5/BMK1(big MAP kinase 1)

  6. MAPK通路的细胞内信号转导过程 生长信号 应激 LPS H2O2 刺激 Raf1 MEKK1 ASK1/MLK ? MKKK MEK1/2 MKK4 MKK3/6 MEK5 MKK JNKs ERK5 p38s MAPK ERK1/2 生长 凋亡 炎症反应 ? 细胞反应

  7. MAPK的作用底物: 转录因子：ATF2、c-Jun、Chop10、 MEF2C、ELK1 胞内蛋白激酶：MAPKAPK2/3、MNK1/2、 PRAK、MSK1/2 骨架相关蛋白：MAPs、Tau、sHSP 离子通道蛋白：

  8. Inflammation Apoptosis Stressresponse Development Cellcycle MAPkinases Survival Proliferation Differentiation Cellular response mediated by MAP kinases

  9. 原始损伤 二次打击 细菌毒素 细胞因子 粘附蛋白 NOS 高温 辐射 病毒 炎症反应过程中的二次打击: MAPK通路

  10. Loop-12 is a key structure to determine the selection of substrate MKK  (...TXY...)--- MAPK  Substrates

  11. 1. 发现和克隆了三个新的p38 亚型和三个新的p38上游激酶

  12. JNK2 JNK3 JNK1 p38 p38 p38 p38 ERK1 ERK2 ERK5 The relationship between the members of MAPK family

  13. Heart Brain Placenta Lung Liver Skeletal Muscle Kidney Pancreas kb p38 3.5- 2.5- p38 p38 2.0- 1.8- p38 Tissue distribution of mRNA of p38 isoforms

  14. Jurket 293 HepG2 U937 Hela kDa 38- p38 39- p38 39- p38 38- p38 The protein expression of p38 isoforms

  15. 77 154 308 400 500 700 77 154 308 400 500 700 B A Osmolarity (mOsmol/L) MBP MBP p38 p38 Activation of p38 and p38 by different osmolarity medium

  16. The major kinases of p38 and p38 B A Control Aniso. Arsenite TNF Control Aniso. Arsenite TNF kDa 97.4- 68.0- 43.9- 29.0- 18.4- 14.3- -80kDa -47kDa -80kDa -47kDa -39kDa

  17. 2. 鉴定了受p38特异性调控的蛋白激酶PRAK

  18. Rsk1 Rsk3 Rsk2 Mnk1 Mnk2 Mapkapk2 Mapkapk3 PRAK 47.9 The ancestral relationships among PRAK related kinases 45 40 35 30 25 20 15 10 5 0

  19. skeletal muscle A lung pancreas placenta kidney liver brain heart -9.5kb -7.5kb -4.4kb -2.4kb HepG2 Jarket 293 A549 Hela -1.5kb B -54kD The distribution of PRAK

  20. Ca 2+ Ionophore Control Aniso. Arsenite H2O2 PMA EGF TNF IL-6 Fold 1.0 4.0 2.5 1.0 0.88 8.4 10.6 20.8 18.7 Activation of endogenous PRAK by various stimuli in vivo HSP27

  21. Effect of individual MAPK pathways on PRAK activity in intact cells MKK1(E) MKK7(D) MKK6(E) Control HSP27 PRAK GST-ATF2 GST-ELK1

  22. MAPKAPK2 PRAK MIX Chromatography Chromatography Chromatography + + + Electrophoresis pH1.9 Electrophoresis pH1.9 Electrophoresis pH1.9 Phosphopeptide map of HSP27 phosphorylated by PRAK in vitro

  23. HSP27 - + + + - - - - - - - - TNF - - - - - + + + - - - - Arsenite - - - - - - - - - + + + PMA - - + - - - + - - - + - SB203580 _ - - - + - - - + - - + PD98059 Effects of SB203580 and PD98059 on endogenous PRAK activity

  24. p38-PRAK(182A) B A GST-PRAK(182D 212D) GST-PRAK(212A 214A) GST-PRAK(182D) GST-PRAK(WT) GST-PRAK(186A) GST-PRAK(182A) GST-PRAK(93A) GST-PRAK(WT) + - - - - + + + p38 - - - - + + + + + p38-PRAK(182D) HSP27 20 15 + Fold of Activation 10 p38-PRAK(wt) 5 0 GST-PRAK(WT) GST-PRAK(93A) GST-PRAK(186A) GST-PRAK(182A) GST-PRAK(182D) GST-PRAK(182D 212D) GST-PRAK(212A 214A) + Electrophoresis pH 8.9 T182 is the regulatory phosphorylation site of PRAK

  25. 3. 提出MAPK L-12磷酸化环状结构影响底物特异性的观点

  26. Loop-12(T-Loop) sequence of MAP kinases MAPK Dural Phosphorylation Sites L-12 Length * * hp38DFGLARHTDD-------------EMTGYVATRWYRAPE 25 hP38bDFGLARQADE-------------EMTGYVATRWYRAPE 25 hp38gDFGLARQADS-------------EMTGYVVTRWYRAPE 25 hp38dDFGLARHADA-------------EMTGYVVTRWYRAPE 25 hJNK1DFGLARTAGTS-----------FMMTPYVVTRYYRAPE 27 hJNK2DFGLARTACTN-----------FMMTPYVVTRYYRAPE 27 hJNK3DFGLARTAGTS-----------FMMTPYVVTRYYRAPE 27 hERK1DFGLARIADPEHDH-------TGFLTEYVATRWYRAPE 31 hERK2DFGLARVADPDHDH-------TGFLTEYVATRWYRAPE 31 hBMK1 DFGMARGLCTSPAEH------QYFMTEYVATRWYRAPE 32 YHOG1DFGLARIQDP-------------QMTGYVSTRWYRAPE 25 YSMK1DFGLARGIHAGFFKCHS--TVQPHITNYVATRWYRAPE 36 YMPK1DFGLARGYSENPVEN------SQFLTEYVATRWYRAPE 32 YKSS1DFGLARCLASSSDSRET---LVGFMTEYVATRWYRAPE 35 YFUS3DFGLARIIDESAADNSEPTGQQSGMTEYVATRWYRAPE 38 domain VII VIII

  27. Construction of p38 loop-12 to ERK like structure p38 ...DFGLARHTDDE------MTGYVATRWYRAPE... p38(E) ...DFGLARHTDDE------MTEYVATRWYRAPE... p38(6+) ...DFGLARHTDDEHDHTGFMTGYVATRWYRAPE... p38(6+E) ...DFGLARHTDDEHDHTGFMTEYVATRWYRAPE... p38(VAP) ...DFGLARVADPE------MTGYVATRWYRAPE... p38(DL) ...DFGLARHTDDD------LTGYVATRWYRAPE... p38(VAPD6+LE) ...DFGLARVADPDHDHTGFLTEYVATRWYRAPE... ERK2 ...DFGLARVADPDHDHTGFLTEYVATRWYRAPE...

  28. Loop-12 is a key structure to determine the selection of substrate MKK  (...TXY...) --- MAPK  Substrates

  29. 4. p38 通过磷酸化MEF2C，调节c-Jun的基因表达

  30. Identification of MEF2C as a substrate for p38

  31. T293,T300 and S387 of MEF2C is p38 phosphorylation sites

  32. Induction of c-Jun through MEF2C phosphorylation by p38

  33. LPS p38 JNK MKK3 MKK6 MKK4 p p JNK p p38 p MEF2C c-Jun p p p c-Jun Gene Expression MEF2C MEF2 site p Cytokine Genes Expression p c-Jun TNF,IL-1,etc. AP1 Inflamatory Reaction

  34. 5. p38在LPS诱导TNF基因表达中起着重要的调控作用

  35. 1 4 1 2 1 0 8 Relative kinase activity 6 4 2 0 0 5 10 20 30 60 90 120 Time (min) Dynamic processes of p38 activation by LPS in RAW cells

  36. 1 5 1 0 Relative luciferase activity 5 Control LPS EGF LPS+FHPI 0 p38 is involved in the enhancement of TNF- promoter transactivity

  37. LPS UV Control LPS、UV刺激心肌细胞共聚焦显微镜大体扫描

  38. p38 p38 p38 p38

  39. p38 p38 p38 p38

  40. Red fluorescence protein（RFP）expression vector

  41. pDsRed1-N1空载体在HeLa细胞中的表达(800) p38RFP融合载体在HeLa细胞中的表达(800)

  42. p38的ATP结合位点在激活后移位的作用 DTKTGLRVAVKKLSRPFQSIIHA 50 60

  43. LBP LPS monocyte macrophage CD14 Rt TK ？ MKKKs MKK3 / 6 p38a、b、g、d PRAK ATF2 MEF2C sHSP ? nucleus CHOP10 SAP1 TNF-a mRNA etc. Cytoskeleton

  44. 本研究的病理学和临床意义: TLR4 虎杖4号 MAPKs 依据不同的靶点选择炎症抑制剂 转录因子 炎症因子 红 、肿 、热 痛、功能丧失 炎症反应 抑制炎症反应

  45. 细胞信号网络 刺激 刺激B 刺激A 刺激C 反应A 反应C 反应B 反应

  46. 细胞信号的反馈调节 刺激 刺激 + - 反应 反应

  47. Serumdepletion ASK1 MKK7 MKK3/6 JNK p38 Transcriptionfactors,suchasc-Jun GSTexpression Celldeathrelatedgeneexpression Celldeath

  48. Types of Interactions(courtesy of K. Kohn)

  49. 目标基因X克隆到DNA-BD载体 随机克隆cDNAs（Y）到AD载体 基因Y 基因X DNA-BD载体 DNA-AD载体 共转染质粒到酵母宿主菌 在合适的培养基上选择生长的共转染菌落 两个杂交蛋白在同一细胞的表达 + DNA-BD/蛋白X杂交蛋白 AD/蛋白Y杂交蛋白 -半乳糖苷酶活性检测， 证实蛋白之间的相互作用 进一步分析阳性克隆 减少假阳性克隆 图7．用Two-hybridsystem筛选与TLR4相互作用蛋白的实验策略 His-TLR4 His-TLR4ic

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