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Staphylococcus. Dra. Elsa Masae Mamizuka USP Dr. Antônio Carlos Pignatari Diretor do Laboratório Especial de Microbiologia - LEMC. Introdução a cocos Gram-positivos Características do Gênero Staphylococcus Staphylococcus aureus Enzimas Extracelulares

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Presentation Transcript
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Staphylococcus

Dra. Elsa Masae Mamizuka

USP

Dr. Antônio Carlos Pignatari

Diretor do Laboratório Especial de Microbiologia - LEMC

ndice

Introdução a cocos Gram-positivos

Características do Gênero Staphylococcus

Staphylococcus aureus

Enzimas Extracelulares

Testes de aglutinação rápida para coagulase

Padrões de Hemólise

Regulação de Fatores de Virulência

Staphylococcus epidermidis

Outras espécies de Staphylococcus

Identificação simplificada dos cocos Gram positivo de importância clínica

Chave Geral para a Identificação de Staphylococcus

Staphylococcus saprophyticus

Detecção de resistência de Staphylococcus aureus à oxacilina e ou vancomicina

Resistência aos Antibióticos

Staphylococcus aureus resistente à oxacilina-ORSA

Métodos laboratoriais para a detecção da resistência à oxaclina ( meticilina)

Resistência à Vancomicina

Detecção da VISA/VRSA

Relação de drogas testadas para Staphylococcus aureus e relatadas no antibiograma

índice

sair

slide3

Introdução a cocos Gram-positivos

sair

índice

Os cocos Gram positivos (CG+) compõem um grupo de grande importância clínica. São responsáveis por inúmeras e variadas afecções e síndromes.

Os CG+ anaeróbios facultativos de importância clínica pertencem a uma de duas famílias:

Micrococcaceae ou Streptococcaceae

Pesquisa de catalase na bactéria

slide4

catalase

2H2O + O2

2H2O2

Introdução a cocos Gram-positivos

sair

índice

A partir da caracterização da amostra como CG+ através da coloração de Gram, a determinação da família é feita pela prova da catalase.

A prova da catalase consiste em colocar uma amostra de bactéria em contato com o peróxido de hidrogênio, e pesquisar a formação de bolhas de oxigênio.

slide5

Introdução a cocos Gram-positivos

sair

índice

-

+

Micrococcaceae

Streptococcaceae

As bactérias desta família são catalase NEGATIVAS

As bactérias desta família são catalase POSITIVAS

slide6

Características do Gênero Staphylococcus

sair

índice

Esta estrutura característica lembra cachos de uva.

slide7

Características do Gênero Staphylococcus

sair

índice

As sp mais importantes na clínica

S. lugundensis

S. carnosus

S. epidermidis

S. capitis

S. schleiferi

S. simulans

S. warnei

S. sciuri

S. cohnii

S. lentus

S. xylosus

S.saccharolyt.

S. caseolyticus

S. saprophyticus

S. caprae

S. gallinarium

S. hominis

S. hyicus

S. chromogenes

S. kloosii

S. haemolyticus

S. intermedius

S. auricularis

S. equorum

S. delphini

S. arlettae

S. aureus

slide8

Características do Gênero Staphylococcus

sair

índice

As mais importantes no laboratório clínico são:

S. lugundensis

S. carnosus

S. epidermidis

S. capitis

S. schleiferi

S. simulans

S. warnei

S. sciuri

S. cohnii

S. lentus

S. xylosus

S.saccharolyt.

S. caseolyticus

S. saprophyticus

S. caprae

S. gallinarium

S. hominis

S. hyicus

S. chromogenes

S. kloosii

S. haemolyticus

S. intermedius

S. auricularis

S. equorum

S. delphini

S. arlettae

S. aureus

slide9

Staphylococcus aureus

sair

índice

De todas as espécies do gênero, o S. aureus é o mais importante. É responsável pelo segundo maior número de infecções em seres humanos.

O S.aureus está presente no trato respiratório superior, especialmente nas narinas, de aproximadamente 60% da população em geral, e assim permanece sem causar doença em condições normais.

slide10

Características do Gênero Staphylococcus

sair

índice

O gênero Staphylococcus é composto por várias espécies:

S. carnosus

S. epidermidis

S. lugundensis

S. simulans

S. capitis

S. schleiferi

S. cohnii

S. warnei

S. sciuri

S.saccharolyt.

S. xylosus

S. lentus

S. caprae

S. saprophyticus

S. caseolyticus

S. hominis

S. gallinarium

S. hyicus

S. haemolyticus

S. kloosii

S. chromogenes

S. auricularis

S. equorum

S. intermedius

S. aureus

S. delphini

S. arlettae

slide11

Staphylococcus aureus

sair

índice

O nome “aureus” significa “dourado” em latim, qualidade atribuída ao pigmento amarelado característico produzido pela bactéria.

slide12

Enzimas Extracelulares

sair

índice

A enzima extracelular mais importante é a coagulase. A produção de coagulase é exclusiva ao Staphylococcus aureus, sendo inclusive, um critério para a identificação de uma amostra como pertencente à espécie.

coagulase

Fibrinogênio

Fibrina

protrombina

Estafilotrombina

Causa coagulação

Fatores de Virulência do Staphylos

Staphylos não é o único que produz coagulase

slide13

Staphylococcus aureus

sair

índice

No laboratório clínico, faz-se um ensaio com plasma de coelho. A bactéria em questão é inoculada num tubo com plasma de coelho. Se o plasma coagular, a espécie é S. aureus.

Se não coagular deixar mais 20h, totalizando 24h verificar novamente

slide14

Proteína A (SpA)

Tem a habilidade de se ligar à porção

FC de IgG, impedindo, portanto que ela

sirva de fator de opsonização na

fagocitose.

Fab

Fab

IgG

Fc

SpA (Atn)

S. aureus

Staphylococcus aureus

sair

índice

slide15

Testes de aglutinação rápida para coagulase

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índice

  • Testa a presença de proteina A e fator de coagulação (clamping factor)
  • Fornece resultado + em 5 a 20 seg.
  • Mostra correlação de 80% com mét.classico
  • preço e mbalagem com 150un. U$116.00
  • Teste de aglutinação do latex azul para detecção do clumping factor e protein A associado à Staphylococcus aureus
  • Resultado em 60 seg
  • Sensibilidade/especificidade: 99/92%
  • Inclui partícula de latex , cartão p/teste, haste, e controles positivo e negativo
  • Preço: embalagem de 105 um. U$ 105.62
  • Validade 18 meses
slide16

Padrões de Hemólise

sair

índice

esverdeado

slide17

Regulação de Fatores

de Virulência

sair

índice

Os fatores de virulência produzidos por S. aureus não são expressados a toda hora, são dependentes da fase de crescimento da bactéria.

  •  Proteína A
  •  adesinas
  •  coagulase
  •  hemolisinas
  • Toxinas

 Alimento em abundância

 alimento

no de células

Taxa estacionária

 Proteína A

 adesinas

 coagulase

 hemolisinas

 toxinas

tempo

slide18

Staphylococcus epidermidis

sair

índice

A segunda espécie mais importante do gênero Staphylococcus é o Staphylococcusepidermidis.

O Staphylococcusepidermidis faz parte da flora normal da pele e da mucosa de seres humanos e animais superiores.

Importante na infecção hospitalar

slide19

Staphylococcus epidermidis

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índice

O Staphylococcusepidermidis é uma espécie bem menos virulenta do que S. aureus. Não apresentam a produção de coagulase e algumas cepas apresentam a produção muito tímida de certas enzimas proteolíticas.

Todavia, isto não significa que S. epidermidis não possa ser patogênico. Esta espécie tem muitos fatores de adesão e forma muito biofilme, sendo perigosa para pacientes que fazem uso de material invasivo de plástico (cateter, próteses, stents, etc.).

slide20

Staphylococcus epidermidis

sair

índice

O Staphylococcusepidermidis é um risco para pacientes imunocomprometidos e para usuários de drogas intravenosas, podendo causar endocardite e infecções generalizadas não-piogênicas.

Staphylococcusepidermidis pode causar septicemia, endocardite, peritonite, ventriculite e infecções em locais com prótese.

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Outras espécies de

Staphylococcus

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índice

No laboratório clínico, usualmente se faz a diferenciação entre Staphylococcus coagulase positiva (S. aureus) e Staphylococcus coagulase negativa (não aureus).

Os Staphylococcus coagulase negativa de interesse são subdivididos em dois grupos: saprophyticus e não saprophyticus, baseado na sua suscetibilidade à novobiocina.

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Outras espécies de

Staphylococcus

sair

índice

No laboratório clínico, usualmente se faz a diferenciação entre Staphylococcus coagulase positiva (S. aureus) e Staphylococcus coagulase negativa (não aureus).

Os Staphylococcus coagulase negativa de interesse são subdivididos em dois grupos: saprophyticus e não saprophyticus, baseado na sua suscetibilidade à novobiocina.

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Identificação simplificada dos cocos Gram positivo de importância clínica

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índice

Gênero Catal. Motilidade NaCl 5% Oxidase Aeróbio Tétrade Estrito

Staphylococcus + neg + neg não não

Planococcus + + + neg + variável

Micrococcus + neg + + variável variável

Enterococcus neg variável + neg não não

Streptococcus neg neg variável neg não não

Aerococcus neg neg + neg não +

Stomatococcus * variável neg neg neg não variável

* aderente ao meio

slide24

Chave Geral para a

Identificação de Staphylococcus

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índice

Coco GRAM +

catalase

Streptococcaceae

-

+

Micrococcaceae

Sensível à

novobiocina?

DNAse

-

+

Staphylococcus sp.

Coagulase

+

Staphylococcus

não saprophyticus

Staphylococcus

aureus

-

+

Staphylococcus grupo saprophyticus

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Outras espécies de

Staphylococcus

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índice

No laboratório clínico, usualmente se faz a diferenciação entre Staphylococcus coagulase positiva (S. aureus) e Staphylococcus coagulase negativa (não aureus).

Os Staphylococcus coagulase negativa de interesse são subdivididos em dois grupos: saprophyticus e não saprophyticus, baseado na sua sensibilidade à novobiocina.

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Chave Geral para a

Identificação de Staphylococcus

sair

índice

Espécies de Staphylococcus

do gruponão saprophyticus

(Grupo epidermidis)

Espécies de Staphylococcus

do grupo saprophyticus

S. epidermidis

S. haemolyticus

S. hominis

S. capitis

S. warneri

S. saprophyticus

S. cohnii

S. xylosus

slide27

Staphylococcus saprophyticus

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índice

O Staphylococcussaprophyticus é de interesse clínico pois frequentemente causa infecção do trato urinário, especialmente em mulheres, podendo chegar a causar cistite, uretrite e pielonefrite, e em casos extremos bacteremia.

As outras espécies de Staphylococcus de interesse clínico causam infecções parecidas com o S. epidermidis, e o tratamento é igual. Logo, o mais importante é discriminar o Staphylococcus coagulase positiva (S. aureus) do Staphylococcus coagulase negativa.

slide29

Resistência aos Antibióticos

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índice

A primeira vez que um antibiótico foi usado, clinicamente, foi contra uma infecção por Staphylococcus aureus.

Sir Alexander Fleming

slide30

Resistência aos Antibióticos

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índice

A penicilina funcionou bem contra infecções estafilocócicas até os anos 60, quando rapidamente começaram a surgir cepas resistentes à penicilina.

slide31

Resistência aos Antibióticos

sair

índice

Para contornar o problema, foi criado o beta-lactâmico sintético meticilina, que era resistente à ação das beta-lactamases.

Anel b-lactâmico

meticilina

slide32

Resistência aos Antibióticos

sair

índice

A meticilina funcionou bem até os anos 70, quando começaram a surgir as cepas resistentes a meticilina (MRSA).

meticilina

slide33

Resistência aos Antibióticos

sair

índice

Todo antibióticos beta-lactâmico se liga a enzimas que participam da síntese da parede celular chamadas PBPs (Proteínas Ligadoras de Penicilina). O MRSA desenvolveu uma outra PBP, chamada PBP2' ou PBP2a. Esta PBP é plenamente funcional mas não tem afinidade por beta-lactâmicos.

penicilina

PBP2a

(PVN) ligadora de penicilina = enzima

slide34

Resistência aos Antibióticos

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índice

Devido a este mecanismo de resistência, as cepas MRSA/ORSA são resistentes não só à penicilina, mas a todos os antibióticos beta-lactâmicos!

No laboratório clínico, deve-se reportar num antibiograma resistência a todos os beta lactâmicos (inclusive cefalosporinas e carbapenemas às vezes são suscetíveis = ocorre apenas “in vitro”) quando a amostra for MRSA mesmo quando são sensíveis a alguns beta lactâmicos in vitro.

A PBP2a é codificada pelo gene mecA. Este gene é carreado num elemento genético móvel chamado de Cassete Cromossômico Estafilocócico mec (SCCmec).

slide35

Staphylococcus aureus

resistente à oxacilina-ORSA

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índice

b la: b -lactamase; CIM em m g/ml; Subp-R: subpopulação resistente.

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Métodos laboratoriais para a detecção da resistência à oxaclina ( meticilina)

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índice

Para detectar a resistência a oxacilina no laboratório clínico, pode-se utilizar a

técnica de disco difusãoem ágar (Kirby-Bauer).

Também pode-se detectar cepas MRSA através de um ágar screening de oxacilina que é ágar Müller-Hinton com NaCl a 4% e uma concentração de oxacilina de 6g/mL de oxacilina. O crescimento de uma ou mais colônias indica resistência a oxacilina.

Para a determinação da concentração inibitória mínima de oxacilina, o método de macrodiluição em caldo deve ser feito com caldo Müller-Hinton com uma concentração final de 4% de NaCl.

slide37

Métodos laboratoriais para a detecção da resistência à oxacilina ( meticilina)

sair

índice

O estudo das CIM mediante prova de E-test com fita de oxacilina é uma alternativa válida em casos de dúvida, com uma eficácia diagnóstica praticamente similar ao do método de referência de dilução em ágar hiper salino, a concentração crítica de 6 µg/ml de oxacilina (NCCLS,1997).

Sistemas automatizados de micro diluição nem sempre oferecem sensibilidade, especificidade e eficácia suficientes para a detecção deste tipo de cepas, quando comparado aos métodos de referência (Sánchez, 1998),

Um método alternativo, rápido e eficaz, embora nem sempre aplicável em rotina, é a detecção do gene mecA, por métodos de amplificação por PCR (Murakami et al., 1991). Este método teria a vantagem de não estar sujeito às condições do crescimento da cepa, podendo ser aplicado em grande número de isolados, empregado em casos de dúvida com valores de CIM próximo do limite.

slide38

sair

índice

slide39

Resistência à Vancomicina

sair

índice

O mecanismo de resistência à vancomicina em Staphylococcusaureus ainda não foi elucidado, e parece ser bem mais complexo do que ocorre em Enterococcus, envolvendo uma multiplicidade de genes.

Em S. aureus, ocorrem fenômenos bizarros e pouco ortodoxos em relação à resistência à vancomicina. Primeiramente, a morfologia das colônias de VRSA é heterogênea, dando a impressão de contaminação.

VSSA

VRSA

VRSA

slide43

Resistência aos Antibióticos

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índice

Em 1997, foi relatada no Japão, a primeira cepa clínica de Staphylococcusaureus resistente à vancomicina (VRSA), pelo Prof. Keiichi Hiramatsu, da Univesidade Juntendo em Tóquio.

slide44

Resistência aos Antibióticos

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Em 2000, foram encontradas as primeiras 5 cepas de Staphylococcusaureus resistentes à vancomicina (VISA) no Brasil, num Hospital de referência de queimados.

Infection Control & Hospital Epidemiology. 22(7):443-448, July 2001.

ISOLATION IN BRAZIL OF NOSOCOMIAL STAPHYLOCOCCUS AUREUS WITH REDUCED SUSCEPTIBILITY TO VANCOMYCIN

Oliveira Geraldo A. MD; Dell'Aquila, Adriana M. MD; Masiero, Rita L. Pharm; Levy, Carlos E. PhD; Gomes, Marcia S. Pharm; Cui, Longzhu PhD; Hiramatsu, Keiichi PhD; Mamizuka, Elsa M. PhD

Faculty of Pharmaceutical Sciences, University of Sao Paulo (Oliveira, Levy, and Mamizuka) General Public Hospital, Sao Paulo, Brazil (Dell'Aquila, Masiero, and Gomes) Department of Bacteriology, Juntendo University, Tokyo, Japan. (Cui, and Hiramatsu)

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Resistência à Vancomicina

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índice

Outro fenômeno comum à oxacilina e a vancomincina é a ocorrência da resistência heterogênea (hetero-resistência) de S. aureus a estes antibióticos. Ocorre que certas cepas apresentam um MIC baixo de vancomicina (<4g/mL), ou a oxacilina (<2g/mL), sendo consideradas sensíveis por métodos tradicionais de avaliação sensibilidade. Todavia, no caso da vancomicina por ex. estas cepas podem conter subpopulações de células que apresentam um MIC  8g/mL, numa freqüência de 1:106 células. Estas células não são detectadas por métodos tradicionais (antibiograma e MIC).

A única forma de se detectar uma cepa hetero-VRSA é através de uma análise de populações, onde se inocula diferentes diluições de uma suspensão bacteriana em meio de cultura sóilido adicionado de concentrações crescentes de vancomicina.

slide46

Resistência à Vancomicina

sair

índice

Quando o resultado é plotado num gráfico obtém-se três possibilidades distintas de curva:

VRSA

hetero-VRSA

VSSA

Sensível à Vancomicina

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Resistência à Vancomicina

sair

índice

Observou-se também, por morfometria, que enquanto as cepas sensíveis à vancomicina apresentavam um espessamento da parede celular normal, VRSA apresentavam uma espessura bem maior, e a hetero-VRSA ficando entre a VRSA e VSSA

slide48

Resistência à Vancomicina

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índice

Parece portanto, que a resistência à vancomicina está ligada a uma exacerbação da síntese da parede celular, em que inúmeros genes regulatórios estariam envolvidos.

Até agora, todavia, ninguém parece saber por certo quais genes estão envolvidos e até que ponto. Uma das grandes limitações no estudo do mecanismo de resistência à vancomicina em S. aureus é que a emergência da resistência é um fenômeno ainda raro. Existem ainda poucas cepas no Mundo atualmente

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Detecção da VISA/VRSA

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Pelo laboratório de referência

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Único macrolídeo disponível por 40 anos!!

Resistência a Macrolídeos

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índice

Os macrolídeos são antibióticos de primeira escolha só para Streptococcus pneumoniae, dentre os Gram positivos.

Os macrolídeos utilizados na clínica são:

  • Eritromicina
  • Claritromicina
  • Azitromicina

O lançamento dos novos macrolídeos recentemente aumentou o uso destas drogas.

slide52

Resistência a Macrolídeos

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índice

Os macrolídeos são inibidores da síntese protéica bacteriana. Os ribossomos bacterianos têm duas subunidades: 30S e 50S.

slide53

aa

Os macrolídeos têm afinidade pela subunidade 50S do ribossoma bacteriano.

mRNA

tRNA

ribossoma

Os macrolídeos interferem na síntese de proteínas por bloquear o sítio ativo do ribossoma por impedimento estérico.

Resistência a Macrolídeos

sair

índice

slide54

Resistência a Macrolídeos

sair

índice

A resistência aos macrolídeos ocorreu pela primeira vez, em 1953. A bactéria metilava o rRNA que perdia afinidade aos macrolídeos.A metilação é feita por uma adenina N6-metiltransferase, cujo gene é denominado erm [Erythomycin Ribosome Methilation].

Os genes erm geralmente estão localizados em elementos genéticos móveis, tal como transposons, geralmente inseridos no cromossoma. Alguns destes transposons residem em plasmídios.

Os genes erm muitas vezes estão associados à presença de genes que conferem resistência à tetraciclina (genes tet).

slide55

As lincosamidas (clindamicina)

e as estreptograminas têm o mesmo alvo (50S rRNA) que é modificado pelos genes erm.

Resistência a Macrolídeos

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índice

Estes antibióticos são denominados como pertencentes ao grupo MLS

slide56

Os genes erm conferem resistência tanto à eritromicina quanto à clindamicina. Mas a resistência à clindamicina só é detectada in vitro com a indução por eritromicina.

erm-

erm+

Resistência a Macrolídeos

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índice

Eritromicina

(bom indutor)

Clindamicina

(mal indutor)

Achatamentodo Halo

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Relação de drogas testadas para Staphylococcus aureus e relatadas no antibiograma

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índice

  • Para Staphylococcus aureus e coagulase negativos oxacilina resistentes, não testar cefalosporinas, penicilinas de amplo espectro ou Imipenem, pois falso resultados sensíveis podem ocorrer.
  • S. saprophyticus mantem boa sensibilidade e não precisam ser testadospois dificilmente apresentam resistência à SMXTMP, quinolonas e nitrofurantoína, (drogas de escolha).
  • Staphylococcus aureus ou coagulase negativos sensíveis à penicilina são sensíveis a todos os beta-lactâmicos. Testar pelo disco de penicilina e não de ampicilina. Se produtoras de beta-lactamase pelo testes acidimétrico, iodométrico ou da cefalosporina cromogênica(nitrocefin) considerar resistente a ampicilina e penicilina.
  • Staphylococcus resistente a penicilina é produtor de penicilinase e éresistente a todas as penicilinas: ampicilina, amoxicilina, piperacilina e ticarcilina. A associação de penicilinas com inibidores: sulbactam, clavulanato e tazobactam só terão atividade para os estafilococos oxacilina-sensíveis.
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Relação de drogas testadas para Staphylococcus aureus e relatadas no antibiograma

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  • Staphylococcus aureus e outros coagulase negativos quando resistentes oxacilina considerar como resistentes a :Penicilinas (penicilina, ampicilina com e sem inibidor de beta-lactamase[sulbactam], amoxicilina com e sem inibidor [clavulanato], piperacilina com e sem inibidor, Ticarcilina com e sem inibidor), cefalosporinas de 1a, 2a, 3a, 4ª , Aztreonam( droga sem atividade contra Gram positivos), e Carbapenens(Imipenem, Meropenem e ertapenem)
  • Staphylococcus spp com teste para gene mecA+= oxacilina R (existem testes de
  • aglutinação específicos para detectar este gene.
  • Staphylococcus spp podem desenvolver resistência durante a terapia com quinolonas, por isso amostras diferentes devem ser sempre testadas e não repetir o antibiograma anterior.
  • Todo Staphylococcus aureus com halo para vancomicina 14mm deve-se testar a CIM e aqueles com CIM4g enviar a Laboratório de referência.