RESISTENCIAS

1. RESISTENCIAS Genotipificación y Fenotipificación Dr. Miguel Arreola HE CMN S XXI México D.F.

2. Ensayos de Resistencia viral a antirretrovirales 2001 Ensayos en desarrollo e investigación Inclusión en guías Estándar de atención X Investigación Comercialización

3. Mutaciones y resistencia en VIH GLOSARIO • Mutación: cambio en composición Genética del VIH • Virus salvaje: conserva constitución genética normal • Virus Mutante o mutado: variante viral con cambios en el genoma. • Genotipo: Secuencia específica de nucleótidos que determina los genes del virus • Fenotipo: Características y propiedades de cada una de las especies virales.

4. Ácido nucleico P P P P P P N3 N3 N3 N3 Base nitrogenada, pentosa, P,

5. Silent Mutation Codón Mutación Silent Mutation AAA GAC AGT AAAAACAGC Lys Lys Asp Ser Asn Ser Mutación • Existen múltiples ensayos • Secuenciación de DNA, hibridación • Todos los ensayos detectan variaciones en la secuencia génica del HIV que afectan las enzimas RT ó PR Adapted from Winters. Reviewed in Wilson. AIDS Read 2000;10:469.

6. Inhibition of HIV-1 DNA synthesis + ARV DNA synthesis P P P P P P N3 OH RT RT ZA Processive DNA synthesis Highly error prone Chain-terminated DNA Reduced viral DNA synthesis Quasispecies Decreased production of viral proteins

7. Nucleoside analogues compete with natural nucleosides for a specific binding site on reverse transcriptase Non- nucleoside reverse transcriptase inhibitors bind elsewhere on the enzyme, and do not compete with natural nucleosides Structure of the HIV RT Although they may act as competitive inhibitors by blocking this site, their main activity is via chain termination

8. ¿Qué es la Resistencia? • El VIH es resistente cuando sigue multiplicándose de forma habitual o mejor, aunque se tome correctamente un medicamento. • La resistencia es la capacidad que cualquier microorganismo -virus, bacteria, etc- puede desarrollar para hacerse no vulnerable a los fármacos que se suministran para combatirlo.

9. ¿A qué se debe la resistencia viral? • Pérdida de sensibilidad del VIH a los efectos inhibitorios de los medicamentos (aumento de la IC50) • Por cambios genotípicos que permiten que el virus se replique aún en presencia del medicamento. • La resistencia con relevancia clínica lleva a aumento de CV (resistencia in vivo).

10. Resistencia con relevancia clínica • Se inicia con cambios en el GT. • Después altera el FT. • La resistencia viral es la pérdida de sensibilidad del virus a los efectos inhibitorios del medicamento. • La resistencia con relevancia clínica es la resistencia viral que lleva a una elevación de la CV (resistencia in vivo).

11. La resistencia es relativa, no absoluta Mutaciones Multiplicación Susceptible Resistente ¿Dónde está la frontera?

12. ¿Porque es importante entender la trascendencia de las resistencias virales en VIH? • Es el mayor factor limitante en la eficacia de un fármaco. • Son un factor importante para la falla del tratamiento. A B • Es factor sustancial en la estrategia de secuenciación necesaria para un correcto tratamiento. A B C D • Disminuye costos de tratamiento antiviral, ya que las fallas de terapia disminuirán y se usarán menos fármacos en más tiempo.

13. ¿Por qué se emplean pruebas de Resistencia? • Predice la falla virológica a un esquema determinado. (primero mutaciones, después resistencia). • Nos ayuda en la elección de un régimen antiviral óptimo (vista hacia adelante). • Las p. de resistencia aparecen con recomendaciones especificas en las guías de tratamiento en VIH. (DHHS, BHIVA, IAS, EACS, otras). • Reduce costos de tratamiento.

14. Ciclo vital del VIH Dinámica Viral • Producción diaria: • 10 billones • 50% del virus se elimina c/6 horas • 1 mutación asoc. a • R por día CD4 TR Integrasa VIH CCR5 Tat CXCR4 Proteasa Rev

15. Resistencias. ¿por qué? • El VIH aprovecha el mecanismo de reproducción de las células para multiplicarse, usando el mismo lenguaje. • Durante el proceso de multiplicación del virus se producen muchos errores (mutaciones) que el virus no es capaz de corregir. Algunas de estas mutaciones pueden resultar en que el virus adquiera nuevas capacidades como la resistencia a fármacos.

16. Resistencias. ¿Cuándo? • Las mutaciones asociadas a resistencia se presentan cuando no se logra un tratamiento supresor. • Además la presión selectiva, que produce el fármaco induce más errores en la replicación viral (mutaciones).

17. t Carga Viral Presión por droga “wild” type virus(susceptible a droga) “mutant” virus(resistente a droga) TIEMPO Dinámica Viral y Resistencia a Drogas

18. Presión de la droga A Presión de la droga B Carga viral TIEMPO “wild” type virussusceptible a fármaco “mutant” virus1X drogoresistente resist cruzada? “mutant” virus(2x drogoresistente, resist cruzada?) Resistencia a Drogas : Selecciónpor Presión de los fármacos.

19. Presión de droga A Carga viral Presión de droga B Presión de droga C Actividad del VIH desactivada TIEMPO (Combinado) Uso de Drogas Anti-VIH optimizado

20. Resistencias. ¿Dónde? • En suero y en reservorios • La tasa de multiplicación de virus es alta y la proporción de virus resistentes puede superar a la cepa original • Finalmente pueden quedar solo cepas resistentes a fármacos.

21. Resistencias. Tipos En base al tiempo de la adquisición de resistencia • Primaria: El virus selecciona preferentemente mutaciones específicas al inicio del contacto con el fármaco y presenta resistencia a este. • Secundaria: El virus adquiere otras mutaciones que aisladamente no confieren resistencia al fármaco

22. Resistencias. Tipos En base a como se detecta la resistencia. • Fenotípica: Mide la resistencia del virus en presencia de determinados fármacos. • Genotípica: cuando se detecta material genético mutado que confiere resistencia a fármacos.

23. Resistencia por etapas, mutaciones puntuales • La aparición paulatina y secuenciada de mutaciones produce un aumento de la resistencia al medicamento. • Resistencia sin etapas, mutaciones “todo o nada”(puntual)

24. Farmacocinética y barrera genéticaa la resistencia APV, IDV, SQV, ZDV, DDI, D4T, ABC Cambio pequeño por mutación Pero bajo nivel de fármaco NNRTIs, 3TC, NFV, APV Altos niveles de fármaco pero Grandes cambios por mutación Lopinavir, TNF Pequeños cambios por mutación Y Altos niveles de fármaco High trough High trough Low trough Incremento en EC50 EC50 EC50 Incremento en número de mutaciones

25. Resistencias.¿Cómo se detectan? • Lo + frecuente: falla virológica o inmunológica • Causas del fracaso de la Terapia ARV no ligadas al fármaco • Falta de adherencia • Absorción intestinal deficiente • Interacciones farmacológicas inadecuadas • Multiplicación viral acelerada en reservorios • Sin alguna de las anteriores: • VIRUS RESISTENTES

26. Pruebas de resistencia Cuando se corrobora la resistencia a ARV, debe tenerse en cuenta, que: • NO TODAS LAS MUTACIONES DEL VIRUS SE TRADUCEN EN RESISTENCIA A ALGUN FARMACO. Sin embargo son tantas las mutaciones que surgen en la multiplicación viral, que ante la presión del fármaco, el virus puede presentar algunas de resistencia.

27. Ensayos de Resistencia a ARV • Test genotípico/ genotipado. Prueba dirigida a determinar la existencia de mutaciones en la secuencia de nucleótidos del genoma viral. • Test fenotípico/ fenotipado. Prueba dirigida a determinar la sensibilidad del virus a una droga. Las resistencias fenotípicas se expresan en función de la concentración inhibitoria (CIx)

28. En base al genotipo usted… • Puede decidir que medicamentos pueden funcionar en el paciente • Complementaría el estudio con un fenotipo • Puede decidir que medicamentos funcionarían (Probabilidad) con el paciente • Tiene la información de la mayoría de las mutaciones que presenta el VIH de la persona estudiada

30. Valores de fenotipos Abordaje tradicional • Los valores usados para establecer la resistencia se obtienen por medio de la variabilidad de ensayos ya determinada por repetición de pruebas de un solo tipo de virus silvestre (Wild type). • Las determinaciones o Cut-offs fueron las mismas para cada fármaco (p.e. 4X, 10X) • pero ¿esto es relevante en la clínica?

31. Valores basados en variación biológica • A muestras de VIH de 1000 pacientes naïve se les realizó fenotipo • Se obtuvieron Valores de promedio y desviación estándar para cada base de datos establecida • Para cada medicamento, el valor fue establecido dentro de 2 desviaciones estándar sobre el promedio • 97.5% muestras susceptibles • 2.5% muestras resistentes

32. En base al fenotipo usted… • Puede decidir que medicamentos no funcionarán con el paciente • (Observa el fracaso). • Puede decidir que medicamentos funcionarán (alta probabilidad) con el paciente. • Tiene la información de la sensibilidad del virus a los distintos medicamentos.

33. Resistencia y potencia Supresiónde la replicación (%) 100 Virus del caso antes del tratamiento Virus del casodespués de la falla 75 50 IC50 IC50 25 0 1 103 106 109 1012 Concentración del medicamento (log)

34. Mutaciones en gen RT Seleccionado por NRTIs M D K (Tipo Silvestre) L T K AZT 41 67 70 210 215 219 1 (Mutante) W YF Q L N R 560 K M L ddI 184 65 74 R V V T ddC 184 65 74 69 D V E 3TC 44 118 184 I D VI V d4T 41 67 70 75 210 215 219 TMSA Y ABC 74 115 67 70 210 215 219 65 41 184 F V Significancia clínica bajo inventigación Mutación Selecionado in vitro

35. Mutación Mutaciones del Gen RT Seleccionados por NNRTIs L K V V Y Y G 106 108 NVP 100 188 181 103 190 I N A I C LH A CI 1 560 P DLV 236 103 181 L C P EFV 100 108 188 190 225 103 L SA H

36. Primaria Secundaria Mutaciones del Gen PRSeleccionado por IP´s L L I V I K V M G M A V L 10 20 24 32 36 46 54 77 82 84 90 71 73 1 IRV I I M MR I I V VT SA AFTS V I L 32 33 36 46 54 71 77 82 84 90 20 10 F IL VL G 10 48 54 77 82 84 90 71 73 V S A D N 10 30 36 46 71 77 82 84 88 90 IL FI N AFTS D I I 10 32 84 46 54 47 50 FIRV V VM I V F L 20 24 53 63 71 82 90 10 84 46 54 P L Adapted from D’Aquila. Topics in HIV Medicine 2001;9:31.

37. Resistencia a múltiples fármacos • ITRNs • Complejo Q151M • Complejo Inserción 69 • MANs (41/67/70/210/215/219) • ITRNNs • 103/188 • 100/106/181/190 • IPs • 46/82/84/90

38. Reporte

39. Resumen • Las mutaciones resistentes aparecen continuamente, en presencia o no de los medicamentos. • Aparecen mas rápidamente con CV elevada; a más replicación más mutaciones. • El GT dicta el FT. • La resistencia es el factor principal que contribuye a la falla pero no es necesariamente la causa. • Si falla el TARAA, la resistencia no es a todos los medicamentos, por ello, las pruebas de GT SON LA MEJOR FORMA DE OPTIMIZAR UN NUEVO MANEJO. • La resistencia fenotípica no se asocia necesariamente a perdida absoluta de la actividad antiviral. • Entender la resistencia es importante para un manejo ÓPTIMO de los casos.

40. Interpretaciones de genotipo sin tener que pensar • (Fenotipo VirtualMR) • Las bases de datos contienen miles de genotipos y fenotipos realizados y guardados • El genotipo del paciente se compara con los especímenes del mismo genotipo • Fenotipo es comparado con los que posee la base de datos y se usan para predecir un promedio del valor de IC50 por fármaco. • !AH! Y... • NUNCA OLVIDE PENSAR!!!!! Larder. Antivir Ther 1000;4(suppl 1):41.

41. Los resultados de las pruebas de resistencia ofrecen ayuda al cuidado estándar por un experto pero de ninguna manera lo reemplazan Francoise Brun-Vezinet