1 / 17

SPECIFIKA ANALÝZY BAKTERIÁLNÍCH SPOLEČENSTEV SEDIMENTŮ POMOCÍ MOLEKULÁRNÍCH DETEKČNÍCH METOD

SPECIFIKA ANALÝZY BAKTERIÁLNÍCH SPOLEČENSTEV SEDIMENTŮ POMOCÍ MOLEKULÁRNÍCH DETEKČNÍCH METOD. UNIVERZITA PALACKÉHO V OLOMOUCI Katedra ekologie a životního prostředí Jana CUPALOVÁ. BAKTERIÁLNÍ SPOLEČENSTVO SEDIMENT Ů HYPOREÁLU A JEHO ANALÝZA.

shel
Download Presentation

SPECIFIKA ANALÝZY BAKTERIÁLNÍCH SPOLEČENSTEV SEDIMENTŮ POMOCÍ MOLEKULÁRNÍCH DETEKČNÍCH METOD

An Image/Link below is provided (as is) to download presentation Download Policy: Content on the Website is provided to you AS IS for your information and personal use and may not be sold / licensed / shared on other websites without getting consent from its author. Content is provided to you AS IS for your information and personal use only. Download presentation by click this link. While downloading, if for some reason you are not able to download a presentation, the publisher may have deleted the file from their server. During download, if you can't get a presentation, the file might be deleted by the publisher.

E N D

Presentation Transcript

  1. SPECIFIKA ANALÝZY BAKTERIÁLNÍCH SPOLEČENSTEV SEDIMENTŮ POMOCÍ MOLEKULÁRNÍCH DETEKČNÍCH METOD UNIVERZITA PALACKÉHO V OLOMOUCI Katedra ekologie a životního prostředí Jana CUPALOVÁ

  2. BAKTERIÁLNÍ SPOLEČENSTVO SEDIMENTŮ HYPOREÁLU A JEHO ANALÝZA • hlavní formou výskytu bakterií v hyporeálu je biofilm, tj. komplex organických látek, mikroorganismů a jejich extracelulárních produktů, pevně vázaný na podklad (substrát) • využití běžných molekulárních detekčních metod není možné bez předchozí úpravy sedimentu (sonifikace, detergenty, hustotní centrifugace)

  3. Problémy spojené s izolací a detekcí baktérií I. • Volba zrnitostní frakce sedimentu pro analýzu • ukotvení bakterie k substrátu i v matrix je velmi pevné a často je možné přerušit je fyzikálními nebo chemickými prostředky pouze u určitého procenta organismů, část tak zůstává nedetekovatelná. • Velikost a aktivita baktérií - bakterie sedimentu jsou často velmi malé a pomalu rostoucí a tím pádem hůře detekovatelné než bakterie volné vody

  4. Dry sediment TPOC 60 % < 1 mm 20 % < 1 mm Grain size < 1mm Grain size < 1mm represents ~20 % of total sediment weight, however, 60 % of total POC of the sediment

  5. < 0.063 mm 0.063 < 1 mm 1 : 9 Grain size fraction < 1 mm Fine fraction Coarse fraction Parameter fine fraction (n)coarse fraction (n) TPOC (mg. g-1DW) 27.1 ± 1.3 (52) 4.0  0.2 (52) Carbohydrates(mgC. g-1DW)26.2  4.2 (16) 0.4  0.1 (16) Bacteria (1010cells.g-1DW) 21.9  38.3 (36) 0.4 ± 0.5 (16) Proteins (g.g-1DW) 189.5  8.3 (32) 95.4  2.7 (31) FDA(mol.g-1DW.h-1) 19.3  23.3 (16) 2.9  1.8 (16)

  6. Celková bakteriální abundance snímek DAPI z epifluorescenčního mikroskopu volná voda, kultivace s přídavkem DOC sediment

  7. Problémy spojené s izolací a detekcí baktérií II. 4. Nízký obsah cílových nukleových kyselin je příčinou slabého nebo dokonce nezachytitelného signálu (excitačního paprsku) a tím často podhodnocení celkové bakteriální abundance (FISH)(Amann et al., 1995). 5. K tomuto problému se v případě detekce in situ často přidružuje ještě tzv. maskování („masking effect“) buněk nečistotami, resp. sedimentem (Kepner et al, 1993).

  8. MOLEKULÁRNÍ DETEKČNÍ METODY- taxonomické složení bakteriálního společenstva snímek FISH z epifluorescenčního mikroskopu sediment volná voda, kultivace s přídavkem DOC

  9. Freeze-core (N2) sonikace Postup při analýze vzorku Odběr vzorků Extrakce buněk ze sedimentu Barvení DAPI a FISH Mikroskopická analýza

  10. rozdělení částic vzorku podle jejich hustoty PŘED CENTRIFUGACÍ PO CENTRIFUGACI 5-(N-2,3-dihydroxypropylacetamido) – 2,4,6 – trijodo –N, N´- bis(2,3- dihydroxypropyl) isophtalamide DETERGENT, SONIKACE A HUSTOTNÍ CENTRIFUGACE PŮSOBENÍ DETRERGENTU A ULTRAZVUKOVÝCH VLN přerušení vazeb bakterie- částice, resp. bakterie- bakterie

  11. ZHODNOCENÍ EFEKTIVITY HUSTOTNÍ CENTRIFUGACE signifikantní rozdíl vzorků před a po centrifugaci (ANOVA, repeated measures; p< 0,05) signifikantní rozdíl vzorků před a po centrifugaci (ANOVA, repeated measures; p< 0,05)

  12. SHRNUTÍ • kombinace využití sonifikace, detergentu a hustotní centrifugace byla posouzena jako vhodná a efektivní pro separaci bakterií a sedimentu • - zařazení těchto „přípravných“ metod před vlastní molekulárně- detekční postupy významně zvýšilo počet detekovatelných bakteriálních buněk

  13. Děkuji Vám za pozornost.

  14. isopyknická centrifugace v hustotním gradientu probíhá výhradně na principu různé hustoty částic, tedy nezávisle na jejich ostatních vlastnostech (velikosti, tvaru, viskozitě aj). Základem je prostředí o měnící se hustotě (hustotní gradient), přičemž rozsah hustot média leží v oblasti očekávaných hustot dělených částic. Hustoty obvykle přibývá od horního okraje centrifugační zkumavky ke dnu. Ultrazvukové vlny o vysoké energii rozrušují agregáty sedimentů, destruují vlákna fibril i kotvící vrstvy exopolymerů, kterými jsou bakterie přichyceny k povrchu, nebo dokonce odtrhávají celé kusy biofilmu. Kromě toho však při určité vlnové délce a intenzitě porušují také struktury vlastních buněk, zapříčiňují jejich praskání a tím možné zkreslení následných detekčních metod Chemické postupy, jejichž cílem je oddělit bakterie od substrátu, pracují především s nejrůznějšími detergenty, tedy obecně látkami, které mají schopnost snižovat povrchové napětí vody a tím výrazně zesilovat její vlastnosti rozpouštědla. Účinnost takových látek však závisí na charakteru vazby bakterie- substrát; jsou-li cílové buňky součástí biofilmu, efektivita použití detergentu může být velmi nízká.

  15. HYPOREÁL HYPOREÁL = veškeré propustné prostředí dna a břehů vodního toku, v němž dochází k mísení vody z toku s vodou podzemní (White, 1993) • ZÁSADNÍ VÝZNAM PRO: • hydrogeologický režim krajiny • ekologii toku (biomineralizace, samočištění)

  16. Freeze-core with liquid nitrogen Sediment analysis Granulometry Biofilm organic carbon (BPOC) Bacterial abundance and biomass Respiration Carbohydrates and proteins Bacterial production Enzyme activity Gas production potential Plant detritus organic carbon Two layers (0-20 cm and 20-50 cm) were separated

More Related