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制限酵素

制限酵素. 制限酵素： Eco RV が DNA 鎖を切断している様子を DNA 鎖の真上方向からから見た図。. restriction enzyme. GAT ATC. CTA TAG. Eco RV が 切断する場所.

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制限酵素

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Presentation Transcript

  1. 制限酵素 • 制限酵素：EcoRV がDNA鎖を切断している様子をDNA鎖の真上方向からから見た図。 restriction enzyme • GATATC • CTATAG EcoRV が切断する場所

  2. 制限酵素は、1968年に、スイスのウェルナー・アーバー(Werner Arber) やアメリカのハミルトン・スミス(Hamilton Othanel Smith) によって発見された。制限酵素の名前の由来としては、大腸菌のある種の株でファージの増殖が制限されるという現象が確認されていたことによるもので、そのような菌からファージのような外来DNAを切断する制限酵素が発見された。(ホスト側のゲノムは、メチル化などの修飾によって保護されているため切断されない) (Werner Arber) (Hamilton O. Smith)

  3. 制限酵素はどんなことを可能にしたのか？

  4. メチル化すると、切れなくなる！ 大腸菌は２つのメチル化酵素を持っている。 メチル化酵素　Dam:GATC 2番目のA（と3番目のTの対鎖のA）がメチルAとなる。 メチル化酵素　Dcm:CC（A/T）GG 2番目のC（と4番目のGの対鎖のA）がメチルCとなる。 かなりの制限酵素はメチルAやメチルCをAやCと認識できないので、 GATCやCC（A/T）GGと二塩基以上重なる場合は切断できないことが起きる。 大腸菌によって増やされる、プラスミドDNAの全てのDam・Dcm部位はメチル化されているので重なった部位は切れない。

  5. I型制限酵素 特異的な認識部位でDNAに結合し、認識部位から様々な距離（400～7000bp）で二本鎖DNAを切断する。活性には、Mg2+, ATP, S-アデノシルメチオニンが必要で、ATP(アデノシン三リン酸)の加水分解に伴って切断が起こる。メチラーゼ活性を併せもつ。 切断個所には再現性が乏しく、また、DNAのメチル化を引き起こすため、遺伝子工学には使えない。 II型制限酵素 • II型の酵素は4～8塩基対の回文構造を認識するものが多い。400種以上知られているが、遺伝子工学の実験に広く利用できることから、その内100種ほどが市販されている。I型やIII型と異なり、DNAのメチル化は起こさない。同じ配列を認識するものでも切断個所を異にする酵素もあり、アイソシゾマー(isoschizomer)と呼ばれる。酵素反応には、Mg2+が必須。

  6. III型制限酵素 特異的な認識部位に結合し、それから約25bp離れた位置を切断する。 活性には、ATPとS-アデノシルメチオニンが必要であるが、ATPの加水分解は伴わない。 I型と同様、メチラーゼ活性を併せもつ。 メチル化活性は、自身の制限酵素で自分のDNAを分解しないために、制限酵素部位をメチル化によってマスクするためにある。 制限酵素の認識する多様な塩基配列のパターン 制限酵素はDNA中にあるそのパターンを認識し、その付近あるいはその配列の内部で切断する。切断された切り口には2種類あり、その形状により平滑末端と突出（粘着）末端と呼ばれる。

  7. TGGCCA TGG CCA ACCGGT ACC GGT A AGCTT AAGCTT TTCGAA TTCGA A Bal1 平滑末端 HindⅢ 突出末端 また、II型制限酵素によって認識される塩基配列のパターンの多くは回文になっており、5'端側から読んでも、その相補鎖の5'端から読んでも同じ配列になっている。 回文（かいぶん）とは上から読んでも、下から読んでも同じ文となる文のことで言葉遊びの一種である。 例） 竹薮焼けた(たけやぶやけた) 肉の多い大乃国(にくのおおいおおのくに)

  8. 定義では、1Unitの制限酵素は50μLの反応液中において60分で1μgの基質DNA（多くはλファージDNA）を完全切断します。定義では、1Unitの制限酵素は50μLの反応液中において60分で1μgの基質DNA（多くはλファージDNA）を完全切断します。 一般的な制限酵素切断 一般的には、1μLの酵素を1μｇの精製DNAに５０μL反応容量で終濃度1倍の至適Bufferをまぜて推奨温度で1時間の反応ですみます。 酵素量を過剰にすると反応時間は短縮されますし、酵素量を少量にして反応時間を延ばして切断することも可能です。

  9. 間違えてとんでもないところを切ってしまう時もあります。間違えてとんでもないところを切ってしまう時もあります。 制限酵素は切る場所を 間違えることはないのか？

  10. 制限酵素のStar活性について 制限酵素を利用するときに注意すべき点は，反応液の組成です。酵素の種類によって反応に最適な塩濃度や pH などが違います。塩濃度が高すぎたり低すぎたり，また pH が大きくずれていたり酵素の濃度が高すぎたりすると，本来なら切らないはずの（認識配列と似ているけれども同一ではない）配列を切ってしまうことがあります。これを制限酵素の Star 活性といいます。 Star 活性を誘導する条件 １、グリセロール濃度が高い「＞5%v/v」 ２、１μｇDNAに対しての酵素のUnit数が高い（酵素によって異なるが、一般に＞100 Unit/μｇ） ３、イオン強度が低い（＜25mM） ４、pHが高い（＞pH8.0） ５、有機溶媒が残存している。 ６、Mg2+の代わりに別の２価イオンに置き換えられてる。（Mn2+,Cu2+,Co2+,Zn2+）

  11. Star 活性を阻害する条件 １、切断が可能な範囲で、できるだけ少量の酵素を使用する。これにより過剰な切断条件をさけるとともに反応時の最終グリセロール濃度を減らすことができる。 ２、DNA調製の際に使用した有機溶媒が除去されていることを確認する。 ３、反応バッファーのイオン強度を100-150mMまで上げる。（酵素活性が塩で阻害されない場合） ４、反応バッファーのpHを7.0まで下げる。 ５、２価の陽イオンとしてMg2+を使用する。 参考URL,文献など http://www.shiyaku-daiichi.jp/special/lec/enzyme/ http://www.mls.sci.hiroshima-u.ac.jp/smg/education/gene_main.html http://133.100.212.50/~bc1/Biochem/Genetech.htm#restriction 制限酵素の基礎知識２００３

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