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第三章  酶

第三章  酶. enzyme. 主讲人：段江燕. 第一节  酶学概论. 一、  酶的概念及其作用特点 1、 酶是一类具有高效率、高度专一性、活性可调节的生物催化剂。 生物催化剂 ： 酶( enzyme) 核酶( ribozyme) 脱氧核酶( deoxyribozyme). 2、 酶与非生物催化剂相比的几点共性： ①催化效率高，用量 少（细胞中含量低）。 ②加快反应速度但不 改变化学反应平衡点。 ③降低反应活化能。 ④反应前后自身结构 不变。. 3、 酶催化反应的特点 （1） 催化效率更高

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  1. 第三章  酶 enzyme 主讲人：段江燕

  2. 第一节  酶学概论 一、  酶的概念及其作用特点 1、酶是一类具有高效率、高度专一性、活性可调节的生物催化剂。 • 生物催化剂 ： • 酶(enzyme) • 核酶(ribozyme) • 脱氧核酶(deoxyribozyme)

  3. 2、酶与非生物催化剂相比的几点共性： ①催化效率高，用量 少（细胞中含量低）。 ②加快反应速度但不 改变化学反应平衡点。 ③降低反应活化能。 ④反应前后自身结构 不变。

  4. 3、 酶催化反应的特点 （1） 催化效率更高 酶催化反应速度是相应的无催化反应的108-1020倍，并且高出非酶催化反应速度至少几个数量级。

  5. ★转换数（TN)或催化常数（Kcat)表示酶的最大催化效率★转换数（TN)或催化常数（Kcat)表示酶的最大催化效率 Kcat是一定条件下（[S]》Km）每秒钟每个酶分子转换底物的分子数（数值上Kcat =K3）

  6. （2）专一性高 酶对反应的底物和产物都有极高的专一性，几乎没有副反应发生。 （3）反应条件温和 常温、常压，中性pH环境。 （4）活性可调节 别构调节、酶的共价修饰、酶的合成、活化与降解等。 （5）酶的催化活性离不开辅酶、辅基、金属离子

  7. 二、酶的化学本质及其组成 （一）酶的化学本质 绝大多数酶是蛋白质 证据 （1）酸水解的 产物是氨基酸，能被蛋白酶水解失活； （2）具有蛋白质的一切共性，凡是能使蛋白质变性的因素都能使酶变性；（具有蛋白质的颜色反应） 少数酶是RNA（核酶）

  8. ★ribozyme核酶（具有催化功能的RNA） （1）80年代初，Thomas Cech和Sidney Altman 四膜虫L19RNA具有生物催化功能，催化rRNA前体的剪接 （2）1983年 Atman和Pace E.Coli RNase P中的RNA具有加工tRNA前体的催化功能

  9. （二）酶的化学组成 单纯酶类(simple enzyme)： 仅由蛋白质组成:脲酶、溶菌酶、淀粉酶、脂肪酶、核糖核酸酶等 缀合酶类（conjugated enzyme): 全酶（holoenzyme)=脱辅基酶（apoenzye)+辅因子(cofactor)： 超氧化物歧化酶Cu2+、Zn2+）、乳酸脱氢酶（NAD+）

  10. ★  酶的辅助因子主要有金属离子和有机化合物 金属离子：Fe2+、Fe3+ 、 Zn2+、 Cu+、Cu2+、 Mn2+、、Mn3+、Mg2+ 、K+、 Na+ 、Mo6+ 、Co2+等。 有机化合物：NAD，NADP，FAD，生物素，卟啉等 辅酶(coenzyme)：与酶蛋白结合较松，可透析除去。 辅基(prosthetic group)：与酶蛋白结合较紧。

  11. 三、单体酶、寡聚酶、多酶复合体、多酶融合体）三、单体酶、寡聚酶、多酶复合体、多酶融合体） 1、   单体酶 由一条或多条共价相连的肽链组成的酶分子 牛胰RNase 124a.a 单链 鸡卵清溶菌酶 129a.a 单链 胰凝乳蛋白酶 三条肽链

  12. 2、   寡聚酶 ①含相同亚基的寡聚酶： 苹果脱胱氢酶（鼠肝），2个相同的亚基 ②含不同亚基的寡聚酶： 琥珀酸脱氢酶（牛心），αβ2个亚基 寡聚酶中亚基的聚合，有的与酶的专一性有关，有的与酶活性中心形成有关，有的与酶的调节性能有关。 ★大多数寡聚酶是胞内酶，而胞外酶一般是单体酶。

  13. 3、   多酶复合体 ★由两个或两个以上的酶，靠非共价键结合而成，其中每一个酶催化一个反应，所有反应依次进行，构成一个代谢途径或代谢途径的一部分。 大肠杆菌丙酮酸脱氢酶复合体由三种酶组成： ①丙酮酸脱氢酶（E1） 以二聚体存在 2×9600 ②二氢硫辛酸转乙酰基酶（E2） 70000 ③二氢硫辛酸脱氢酶（E3） 以二聚体存在 2×56000 12个E1 二聚体 24×96000 24个E2 单体 24×70000 6个E3 二聚体 12×56000 总分子量：560万

  14. 4、   多酶融合体（多功能酶） ★一条多肽链上含有两种或两种以上催化活性的酶，往往是基因融合的产物。 例如：天冬氨酸激酶I---高丝氨酸脱氢酶I融合体（双功能酶） 该酶是四聚体α4，每条肽链含两个活性区域：N-端区域是Asp激酶，C端区域是高Ser脱氢酶

  15. 四、酶的分类及命名 （一）、习惯命名 1.依据底物来命名（绝大多数酶）： 蛋白酶、淀粉酶 2. 依据催化反应的性质命名： 水解酶、转氨酶 3 结合上述两个原则命名：琥珀酸脱氢酶。 4. 有时加上酶的来源 胃蛋白酶、牛胰凝乳蛋白酶

  16. （二）、国际系统命名 ★★基本原则：明确标明酶的底物及催化反应的性质（底物为水时可略去不写）。 谷丙转氨酶的系统名称： 丙氨酸：α-酮戊二酸氨基转移酶

  17. ★★国际系统分类法及编号（EC编号） （1）按反应性质分六大类，用1、2、3、4、5、6表示。 （2）根据底物中被作用的基团或键的特点，将每一大类分为若干个亚类，编号用1、2、3 。 （3）每个亚类又可分为若干个亚一亚类，用编号1、2、3表示。 每一个酶的编号由4个数字组成，中间以“·”隔开。 第一个数字表示大类，第二个数字表示亚类，第三个表示亚-亚类，第四个数字表示在亚-亚中的编号。

  18. 乙醇脱氢酶EC1.1.1.1 ， 乳酸脱氢酶EC1.1.1.27 ， 苹果酸脱氢酶EC1.1.1.37 第一个数字表示大类： 氧化还原 第二个数字表示反应基团：醇基 第三个数字表示电子受体：NAD+或NADP+ 第四个数字表示此酶底物：乙醇，乳酸，苹果酸。

  19. 1、   氧化还原酶类 催化氧化还原反应： A·2H+B=A+B·2H 乳酸：NAD+氧化还原酶（EC1.1.1.27）， 习惯名：乳酸脱氢酶 2、   转移酶类 AB+C=A+BC Ala：酮戊二酸氨基移换酶（EC2.6.1.2）， 习惯名： 谷丙转氨酶

  20. 3、   水解酶类 催化水解反应，包括淀粉酶、核酸酶、蛋白酶、脂酶。 亮氨酸氨基肽水解酶（EC3.4.1.1）， 习惯名： Ile氨肽酶。 4、   裂合酶类（裂解酶） 催化从底物上移去一个基团而形成双键的反应或其逆反应 二磷酸酮糖裂合酶（EC4.1.2.7）， 习惯名：醛缩酶

  21. 5、   异构酶（EC5.3.1.9） 催化同分异构体相互转化 6-磷酸Glc异构酶 6、   合成酶（连接酶） 催化一切必须与ATP分解相偶联、并由两种物质合成一种物质的反应。 L-酪氨酸：tRNA连接酶（酪氨酰tRNA合成酶）

  22. ◆国际分类的盲区：忽略了酶的物种差异和组织差异◆国际分类的盲区：忽略了酶的物种差异和组织差异 SOD： EC1.15.1.1，只有一个名称和编号 2O2-+2H+→H2O2+O2 三类不同的SOD： CuZn-SOD 真核生物细胞质中 Mn-SOD 真核生物线粒体中 Fe-SOD 同是CuZn-SOD，来自牛红细胞与猪红细胞的，其一级结构也有很大不同。 ★在讨论一个具体的酶时，应对它的来源与名称一并加以说明。

  23. 五、酶的专一性 （一）酶专一性类型 1、   结构专一性 （1）、相对专一性 ★键专一性（对底物结构要求最低） ★基团专一性Group Specificity 不仅对键有要求，还对键一端的基团有要求，但对另一端基团要求不严格。 α—D—Glc苷酶，水解蔗糖和麦芽糖。 （2）、绝对专一性 只能作用于一个底物，或只催化一个反应。 麦芽糖酶只作用于麦芽糖，脲酶只催化尿素水解。

  24. 2、   立体异构专一性 （1）、旋光异构专一性 （2）、几何异构专一性 反丁烯二酸水化酶只催化反丁烯二酸生成苹果酸 立体化学专一性还表现在酶能区分从有机化学观点看属于对称分子中的两个等同的基团，并只催化其中一个，而对另一个无作用。 a. 甘油激酶只催化甘油中的一个CH2OH磷酸化。 b. 顺-乌头酸酶只作用于柠檬酸的两个-CH2COOH中的一个。 立体专一性在实践中的应用： 药物的不对称合成或不对称拆分。 用乙酰化酶制备L—氨基酸

  25. （二）酶作用专一性的解释 1、锁钥模型(lock-key hypothesis) Fisher 1894 酶活性中心的形状与底物分子形状互补。 底物分子或其一部分像钥匙一样，专一地插入酶活性中心，通过多个结合位点的结合，形成酶—底物复合物。 酶活性中心的催化基团正好对准底物的有关敏感键，进行催化反应。

  26. 2、  诱导楔合模型(induced-fit hypothesis) 酶分子与底物分子接近时，酶蛋白质受底物分子诱导，构象发生有利于与底物结合的变化，酶与底物在此基础上互补楔合，进行反应。

  27. 六、酶的活力测定与分离纯化 1、   酶活力与酶促反应速度 酶活力：在一定条件下，酶催化某一反应的反应速度（一般测初速度）。 酶促反应速度：单位时间、单位体积中底物的减少量或产物的增加量。 单位：浓度/单位时间

  28.  研究酶促反应速度，以酶促反应的初速度为准(底物消耗≤5%）。

  29. 2、   酶的活力单位（U） 国际单位（IU单位）： 在最适反应条件下，每分钟催化1umol底物转化为产物所需的酶量，称一个国际单位（IU），1 IU = 1umol /min 国际单位（Katal, Kat单位）： 在在最适反应条件下，每秒钟催化1mol底物转化为产物所需的酶量，称Kat单位 1 Kat=60 X 106 IU

  30. 一级反应 零级反应 V V [sucrose] [enzyme] 最适条件：最适温度（25℃或37 ℃）,最适pH、最适缓冲液离子强度、最适底物浓度。 底物浓度（1）通常很大，使酶饱和 （2）底物消耗≤5%

  31. 3、   酶的比活力Specific activity 每毫克酶蛋白所具有的酶活力。 单位：U/mg蛋白质。 酶的比活力是分析酶的含量与纯度的重要指标。

  32. 一个酶的分离纯化分为4 步。 步骤 1 2 3 4 总活力（U） 6 4 3 2 总蛋白质（mg） 20 10 5 2 比活力（U/mg） 6/20 4/10 3/5 2/2 酶的提纯过程中，总蛋白减少，总活力减少，比活力增高。 酶的纯化倍数： 酶的回收率： ×100%

  33. 4、酶活力的测定方法 分光光度法 荧光法 同位素法 电化学法

  34. 七、酶工程简介及其它酶 1、酶工程的定义及分类： “酶工程”是指酶制剂在工业上的大规模生产及应用。分为两大类：化学酶工程和生物酶工程。 化学酶工程亦可称为初级酶工程(Primary enzyme engineering)，它主要由酶学与化学工程技术相互结合而形成。通过化学修饰、固定化处理、甚至通过化学合成法等手段，改善酶的性质以提高催化效率及降低成本。包括自然酶、化学修饰酶、固定化酶及化学人工酶的研究和应用。 生物酶工程是在化学酶工程基础上发展起来的，是以酶学和DNA重组技术为主的现代分子生物学技术相结合的产物。因此它亦可称为高级酶工程

  35. 2、核酶 • 核酶（ribozyme）主要指一类具有催化功能的RNA，亦称RNA催化剂。核酶是1982年，Cech等研究原生动物四膜虫rRNA时，首次发现RRNA基因转录产物的I型内含子剪切和外显子拼接过程可在无任何蛋白质存在的情况下发生，证明了RNA具有催化功能。

  36. 3、抗体酶 • 1946年，鲍林(Pauling)用过渡态理论阐明了酶催化的实质，即酶之所以具有催化活力是因为它能特异性结合并稳定化学反应的过渡态(底物激态)，从而降低反应能级。 • 抗体酶具有典型的酶反应特性；与配体(底物)结合的专一性，包括立体专一性，抗体酶催化反应的专一性可以达到甚至超过夭然酶的专一性；具有高效催化性，一般抗体酶催化反应速度比非催化反应快104～108倍，有的反应速度已接近于天然酶促反应速度；抗体酶还具有与天然酶相近的米氏方程动力学及pH依赖性等。

  37. 4、同工酶 • 同工酶（Isozyme）存在于同一种属生物或同一个体中能催化同一种化学反应，但酶蛋白分子的结构及理化性质和生化特性（Km、电泳行为等）存在明显差异的一组酶。它们是由不同位点的基因或等位基因编码的多肽链组成。

  38. 第二节酶促反应动力学 研究酶促反应的速度以及影响酶促反应速度的各种因素，包括底物浓度、酶浓度、pH、温度、激活剂与抑制剂等。

  39. 一、中间复合物假说与米式方程 1、中间产物假说： 酶与底物先络合成一个中间产物，然后中间产物进一步分解成产物和游离的酶。

  40. 2、米式方程： Michaelis和Menten 1913年 Ks为底物解离常数（底物常数）

  41. 米式方程的导出： （1）、  早年的米式方程基于快速平衡假说 ①在反应的初始阶段，[S]远远大于[E]，因此，[S]可以认为不变。 ②因为研究的是初速度，P的量很小，由P+E ES可以忽略不记。 ③游离的酶与底物形成ES的速度极快（快速平衡），而ES形成产物的速度极慢，故， [ES] 的动态平衡与ES P+E没有关系 （既 K1、K2 ＞＞K3 ）

  42. ES的生成速度：K1（[E] - [ES]）[S] ES的分解速度：K2[ES] K1（[E] - [ES]）[S] = K2[ES] 反应速度： KS现在称为底物常数

  43. (2)、“稳态平衡假说”及其对米式方程的发展：(2)、“稳态平衡假说”及其对米式方程的发展： Briggs和Haldane 1925 [ES]的动态平衡不仅与 E+ S  ES有关，还与ES  P + E有关。 稳态平衡假说的贡献在于发展了快速平衡学说的第③点。 所谓“稳态”：ES的形成速度与分解速度相等、ES的浓度保持不变的反应状态

  44. 用稳态假说推导米式方程： ES生成速度： k1（[E] - [ES]）[S] ES分解速度： k2[ES]+k3[ES] 以上两个速度相等： k1（[E] - [ES]）[S] = k2[ES]+k3[ES]

  45. （单体酶） （寡聚酶） （米氏常数） Vmax=k3 [E] 当Km及Vmax已知时，根据米氏方程可确定酶反应速度与底物浓度的关系。

  46. 当[S]《Km时 当[S]》Km时 当[S]=Km时

  47.   3、Km的物理意义 *当反应速度v=1/2 Vmax时， Km = [S]， Km的物理意义是：当反应速度达到最大反应速度一半时底物的浓度。 单位：mol·L-1或mmol·L-1 *Km是酶的特征常数之一。一般只与酶的性质、底物种类及反应条件有关，与酶的浓度无关。

  48. V 1/2Vmax Km [S]    *Km最小的底物称该酶的最适底物或天然底物。 Km愈小（达到Vmax一半所需的底物浓度愈小）表示V对△[S] 越灵敏。

  49. ★Km是ES分解速度（K2+K3）与形成速度（K1）的比值，它包含ES解离趋势（K2／K1）和产物形成趋势（K3／K1）。★Km是ES分解速度（K2+K3）与形成速度（K1）的比值，它包含ES解离趋势（K2／K1）和产物形成趋势（K3／K1）。 ★Ks是底物常数，只反映ES解离趋势（底物亲和力），1/Ks可以准确表示酶与底物的亲和力大小。 ★只有当K1 、K2》K3时，Km≈Ks，因此，1/Km只能近似地表示底物亲和力的大小。 ★底物亲和力大不一定反应速度大（反应速度更多地与产物形成趋势 K3／K1有关）

  50.   * Km与米式方程的实际用途 （1）根据[S]求V （2）根据V（或相对速度a）求[S] （单体酶） （寡聚酶）

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