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恶性肿瘤的分子靶向治疗 Targeting Molecular Therapy for Malignant tumors

恶性肿瘤的分子靶向治疗 Targeting Molecular Therapy for Malignant tumors. 中南大学肿瘤研究所 向娟娟 ( xiangjj@csu.edu.cn ). 靶向治疗： 药物有针对性地瞄准预期的靶位，而不伤及其他正常细胞、组织或器官。 靶向治疗分三个层次：器官靶向、细胞靶向和分子靶向. 分子靶向的分类. 基因治疗 细胞信号转导通路 肿瘤抗原 细胞因子 肿瘤血管生成 内分泌治疗. 肿瘤基因治疗中靶向性治疗策略. 背景 （ background). 传统的治疗方式有一定的限制（手术治疗，化疗，放疗）。

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恶性肿瘤的分子靶向治疗 Targeting Molecular Therapy for Malignant tumors

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Presentation Transcript

  1. 恶性肿瘤的分子靶向治疗Targeting Molecular Therapy for Malignant tumors 中南大学肿瘤研究所 向娟娟 (xiangjj@csu.edu.cn)

  2. 靶向治疗： 药物有针对性地瞄准预期的靶位，而不伤及其他正常细胞、组织或器官。 • 靶向治疗分三个层次：器官靶向、细胞靶向和分子靶向

  3. 分子靶向的分类 • 基因治疗 • 细胞信号转导通路 • 肿瘤抗原 • 细胞因子 • 肿瘤血管生成 • 内分泌治疗

  4. 肿瘤基因治疗中靶向性治疗策略

  5. 背景 （background) • 传统的治疗方式有一定的限制（手术治疗，化疗，放疗）。 • 分子靶向治疗（molecular targeted therapy)受到密切的关注。 • 基因治疗是分子治疗的一种手段，有很大的应用前景。 • Dr Anderson（1980）首先阐明基因治疗前景和发展方向 • 我国是世界上较早开展基因治疗研究的国家之一 • 1991年，我国科学家进行了世界上首例B型血友病患者的基因治疗临床试验。 • 2003年世界首个基因治疗药物在我国获准生产的新药：拥有自主知识产权的重组人p５３腺病毒注射液

  6. 1953J. D. Watson＆F. H. C. Crick提出DNA双螺旋结构。1989HGP——人类基因组计划启动。 1990HGTS批准了第一个具有治疗作用基因治疗方案，即ADA基 因植入先天性腺苷脱氨酶缺乏症患者体内，于当年9月14 日完成世界上首例基因治疗试验。 1991年，我国科学家进行了世界上首例B型血友病患者的基因治 疗临床试验。 1991FDA公布了“体细胞治疗和基因治疗的指导原则”，进一 步修订后于93年形成法规执行。中国卫生部亦于93年颁布 了这一法规。2003-04第一个基因治疗产品将上市用于肿瘤治疗，由此将带动 整个基因治疗产业的迅速发展。 时间(年)重要里程碑事件

  7. 基因治疗概念 将具有正常功能的基因（人的正常基因或有治疗作用的基因）通过一定方式导入人体靶细胞，置换、增补或抑制患者体内有缺陷的基因，从而达到治疗疾病的目的。

  8. 基因治疗的基本方式 • 基因置换 （gene replacement） • 基因增补（gene augmentation） • 基因失活（gene inactivation）

  9. 基因置换（gene replacement） • 定义：所谓基因置换,是指目的基因导入靶细胞后,通过目的基因与靶细胞内染色体上内源DNA序列间的交换,将目的基因定点整合到靶细胞基因组上某一确定位点的技术，置换原有的缺陷基因，使致病基因永久地得到更正。 • 目的：将缺陷基因的异常序列进行矫正。对缺陷基因的缺陷部位进行精确的原位修复。 • 目前的技术水平难以达到

  10. 基因增补（gene augmentation） 基因添加或称基因增补:基因增补指将目的基因导入病变细胞或其他细胞，不去除异常基因，而是通过目的基因的非定点整合，使其表达产物补偿缺陷基因的功能或使原有的功能得到加强。目前基因治疗多采用此种方式。

  11. 基因失活（gene inactivation）： 反义核酸是指能与特定mRNA或者DNA互补、特异阻断其转录或翻译的RNA或DNA分子。反义核酸技术, 指将特定的反义核酸导入细胞，通过碱基互补作用与mRNA或DNA结合，阻断细胞中基因的异常表达。 包括：反义RNA;反义DNA；核酶（负性调节作用因子);decoy等 • 人工合成的短小反义寡聚核苷酸(antisense oligodeoxyncleotides，AON)，这是反义核酸最普遍的应用方式； • 人工表达载体；

  12. Simple in Theory, Complex in Practice

  13. 主要挑战 • 如何在足够多的特定的细胞里获得有效的基因转染，并保证一定的时效。这个挑战的难度由不同的疾病，疾病的位置，靶细胞的特点以及合适的基因载体决定。

  14. 基因转移的途径： 1. 直接体内法 （in vivo):将外源性基因直接导入受者体内的组织器官或者细胞内 2. 离体法 （ex vivo)：即先分离和培养受体细胞，在体外将外源基因导入载体细胞，然后将基因转染后的细胞回输给受者

  15. 基因治疗的两种途径1. 直接体内法 （in vivo)； 2. 离体法 （ex vivo) 靶细胞 ex vivo 载体 目的基因 in vivo

  16. 基因转移(gene transfer)技术： 1.病毒介导的基因转移系统 2.非病毒介导的基因转移系统 3.细胞介导的治疗 4.直接注射法

  17. 病毒介导的基因转移系统 病毒载体介导的基因转移效率较高， 因此它也是使用最多的基因治疗载体。

  18. 病毒载体介导的基因转移方法 • 慢病毒载体介导法； • 逆转录病毒载体； • 腺病毒载体； • 腺相关病毒载体; • 单纯疱疹病毒(HSV)载体介导法

  19. （1）慢病毒 (lentivirus)

  20. tat 基因编码的gp14 是一种反式激活的转录因子,与LTR 合后能促进病毒所有基因的转录 Rev蛋白需要与Rev反应元件(RRE)相作用，将未剪切的载体转录产物从细胞核转运到胞浆 编码病毒的核衣壳蛋白(p7) 、内膜蛋白(p17) 和衣壳蛋白(p24) 产物与病毒的装配、成熟和释放有关 编码产物与病毒体的感染性有关 pol 基因编码病毒复制所需的酶类 tat 基因编码的gp14 是一种反式激活的转录因子,与LTR 结合后能促进病毒所有基因的转录 nef 基因编码负调节蛋白 env 编码gp120 和gp41 两种包膜糖蛋白,决定病毒感染宿主的靶向性 rev 基因编码的产物gp19 能促进未经拼接的大mRNA 分子从细胞核向胞浆转运

  21. 第三代慢病毒表达系统的安全特点 • 去除了3’ LTR (ΔU3)，使其不再有启动/增强活性，从而形成了所谓的“自灭活”（Self-inactivation，SIN） • 只保留了三个结构基因（gag, pol, and rev). • HIV-1的包膜蛋白来源于疱疹性口炎病毒 • 编码结构和包装病毒基因组所需的其他成分的基因分散到4个质粒。这些质粒相互之间没有同源性，减少重组现象。 • 三个包装质粒都不包含LTRs或者包装序列，所以HIV-1结构基因不表达于靶细胞中，不能产生新的病毒复制 • 产生的病毒颗粒没有复制功能，只是携带基因，即可在细胞上清中收获只有一次性感染能力而无复制能力的、携带目的基因的HIV-1载体颗粒。

  22. 腺病毒(adenovirus，AV)载体 腺病毒是一种大分子(36 kb)双链无包膜DNA病毒。它通过受体介导(柯萨奇病毒腺病毒受体, coxsackie and adenovirus receptor，CAR)的内吞作用进入细胞内，然后腺病毒基因组转移至细胞核内，保持在染色体外，不整合进入宿主细胞基因组中。 。

  23. 非病毒载体介导的基因转移系统 脂质体和多聚阳离子 基本原理:利用脂质体与DNA混合后，形成包裹外源DNA的脂质体，可通过细胞内吞作用将外源DNA（即目的基因）转移至细胞内，并进行表达。 脂质体可分为阳离子脂质体和阴离子脂质体

  24. 脂质体介导的基因转移示意图

  25. 基因直接注射技术 不需要进行基因工程的繁琐操作，直接将裸露基因DNA注入动物肌肉或某些器官组织内。

  26. 不同载体系统的特性比较 载体 基因容量 细胞种类 滴度 导入途径 整合 免疫反应性 安全性 逆转录病毒 7.5kb 分裂细胞 108 ex vivo 是 弱 插入突变 慢病毒 8kb 分裂细胞 108ex vivo是 弱插入突变 非分裂细胞 in vivo 腺病毒 30kb 分裂细胞 1011ex vivo 否 强 毒性小 非分裂细胞 in vivo 腺相关病毒 5.2kb 分裂期细胞 1012 ex vivo 是/否 未知 毒性小 非分裂期细胞 in vivo 非病毒载体 不受限制 不受限制 ex vivo很难 无 毒性小 in vivo

  27. 目的基因转移的靶向性

  28. 病毒介导的靶向基因转移 • 受体/配体或抗原/抗体介导的靶向基因转移

  29. 受体介导转移技术示意图

  30. 目的基因表达的靶向性 • 组织特异性调控元件调控基因转录(PSA,CEA,SP-A） • 肿瘤特异性调控元件调控基因表达（hTERT, FLK-1,E2F, HRE)

  31. 治疗基因的受控表达 • 可诱导表达系统 （tet-on/off) • 特异反应性诱导表达系统(电离辐射，缺氧） • 调控序列对基因表达 （组织特异性启动子） • 目的基因的长期表达

  32. 细胞介导的基因治疗 （cell based gene therapy) • 干细胞 • 免疫细胞 • 内皮细胞

  33. Science. 2003 Oct 17;302(5644):415-9. LMO2-associatedclonalTcellproliferation in twopatientsaftergenetherapy for SCID-X1.

  34. 基因治疗有待解决的问题 1、难以获得真正有治疗作用的基因 2、外源基因的表达难以在体内精确调控 3、体细胞经体外培养后，其生物学特性会有改变 4、过多的外源蛋白对机体带来可能的影响 5、随机整合潜在的威胁genotoxicity

  35. 针对信号转导的靶向治疗

  36. 癌基因成瘾：原癌基因成瘾性指恶性肿瘤细胞比正常细胞更加依赖原癌基因，即正常细胞没有原癌基因的活化或有原癌基因微弱的活化便可继续生存，而恶性肿瘤细胞则必须通过原癌基因的大量活化进而参与细胞周期中的关键过程方能延续生命。这意味着如果能够切断或弱化这些活化的原癌基因，恶性肿瘤细胞就能被杀死，而正常细胞不会受到影响。基于对恶性肿瘤细胞的针对性，这种新的治疗方法被称为“靶向治疗”。

  37. 信号转导的基本概念 • 信号转导的基本概念是：细胞外因子通过与受体（膜受体或核受体）结合，引发细胞内的一系列生物化学反应，直至细胞生理反应所需基因表达开始的过程。

  38. 受体的分类 1质膜受体 （1）离子通道受体 （2）催化受体 即酶联受体 （3）G蛋白偶联受体 2胞内受体 （1）胞质受体 （2）核内受体

  39. GPCR与肿瘤靶向治疗 • 受体-G蛋白-Ac途径 （腺苷酸环化酶 ） • 受体-G蛋白-PLC途径（磷脂酶C）

  40. 酶耦联受体通路与肿瘤治疗

  41. 5种类型酶耦联受体 • 受体鸟苷酸环化酶 • 受体酪氨酸激酶 • 酪氨酸激酶相关受体 • 受体酪氨酸磷酸酶 • 受体丝氨酸/苏氨酸激酶

  42. 受体酪氨酸激酶的分类 • 表皮生长因子（EGF）受体； • 血小板生长因子（ PDGF）受体和巨噬细胞集落刺激生长因子（M-CSF）； • 胰岛素和胰岛素样生长因子-1（IGF-1）受体； • 神经生长因子（NGF）受体； • 成纤维细胞生长因子（FGF）受体； • 血管内皮生长因子（VEGF）受体和肝细胞生长因子（HGF）受体等。

  43. 配体毒性交联剂 • 单克隆抗体 • 酪氨酸激酶抑制剂 • 反义核酸技术

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