PRUEBAS DE DIAGNÓSTICO RÁPIDO EN MICROBIOLOGÍA

1. PRUEBAS DE DIAGNÓSTICO RÁPIDOEN MICROBIOLOGÍA Raúl Gil Orts MIR 2 Análisis Clínicos

2. INDICE • INTRODUCCIÓN • TINCIONES • CULTIVOS • TÉCNICAS DIRECTAS • MÉTODOS MOLECULARES • MALDI-TOF • TÉCNICAS FUTURAS

3. INTRODUCCIÓN • -Procesos manuales • Pruebas que se realizan directamente en la muestra y permiten detectar la presencia de microorganismos o de fragmentos de los mismos en las muestras. • Técnicas aplicadas a procesos habituales que permiten acortar de manera significativa el tiempo necesario para facilitar el resultado • - Especialmente útiles cuando el agente causal crece lentamente o no crece en los medios de cultivo. • - Los resultados no se ven alterados por la administración previa de antimicrobianos. • - Inconveniente: no ofrece información sobre la sensibilidad a los antimicrobianos

4. TINCIÓN • Se realizan sobre la muestra obtenida y procesada adecuadamente • - Morfología microscópica y características tintoriales

5. Tinción

6. Tinción

7. TINCIÓN GRAM neumococo

8. TINCIÓN GRAM Exudado uretral: Neisseria gonorrea LCR: Neisseriameningitidis

9. TINCIÓN Blanco calcoflúor Candidaalbicans

10. TINCIÓN Auramina Zhiel-Neelssen

11. TINCIÓN Tinta China Cryptococcusneoformans

12. CULTIVOS BACTERIANOS Nivel Hemocultivos - Forma tradicional - Incubación frascos hemocultivos. (8-24 horas) - Tinción de Gram y cultivo en medios sólidos + ATB (24-48h) - Técnica rápida - Procesar directamente la sangre del frasco hemocultivo Extraer 10 ml de sangre Centrifugar 3 ml sobrenadante Repartidos 2 tubos Eppendorf 13000 rpm 1 min Centrifugar 1500 rpm 5 min IDENTIFICACIÓN - 3-4h ANTIBIOGRAMA – 6-12h SEDIMENTO - LIQUIDO ASCÍTICO, L. ARTICULAR, L. PLEURAL

13. TÉCNICAS DIRECTAS • Técnicas diagnósticas que se aplican directamente en una muestra patológica (orina, sangre, frotis nasofaríngeos, heces, LCR) • mínima manipulación • reducen el tiempo del proceso analítico • -También denominadas “point-of -care test“ • Beneficio: • Permiten administrar el tratamiento adecuado en el menor tiempo mejor evolución enfermedad • técnicas : • Inmunocromatografía • Enzimoinmunoanálisis • Inmunofluoerescencia indirecta • - PCR a tiempo real

14. TÉCNICAS DIRECTAS

15. TÉCNICAS DIRECTAS

16. TÉCNICAS DIRECTAS Antígeno neumococo Antígeno legionella Plasmodium Antígeno VRS

17. TÉCNICAS DIRECTAS S. pyogenes Rotavirus Toxina C. difficile Entamoebahystolitica EIA

18. MÉTODOS MOLECULARES PNA-FISH - peptidenucleicacidfluorescent in-situ hybridization - Se emplean cebadores fluorescentes que hibridan con los pares de bases de nucleótidos contenidos en el ARN ribosomal de los microorganismos. - Útil para detectar bacteriemias por S. aureus, E. coli, Enterococcusspp, Ps.Aruginosao fungemias por Candidaspp. En aproximadamente 3 horas

19. Métodos moleculares PNA-FISH Ps.aeruginosa S. aureus

20. MÉTODOS MOLECULARES PCR en tiempo real - Modificación de PCR convencional - Mejora la rapidez en la detección - Mejora en Sensibilidad y Especificidad - Detecta a la vez que amplifica - Sistema cerrado: evita contaminaciones y pérdida de tiempo con el empleo de geles agarosa - Sensibilidad y especificidad igual o superior al 95% - Tiempo de ejecución 1.5 horas

21. MÉTODOS MOLECULARES • PCR a tiempo real • - Test comercializados: • - Detección MRSA en frotis nasales • - Detección Enterococcusspp. resistentes a glucopéptidos en frotis rectales • - Clostridiumdifficileen heces • - S. agalactiaeen frotis vaginal y rectal en embarazadas • - Enterovirus en LCR • - Cuantificación de citomegalovius, VIH o hepatitis C

22. MÉTODOS MOLECULARES PCR t.r. Detección: - S. aureus resistente a meticilina - Clostridiumdifficile - Enterovirus en LCR - S. agalactiae

23. MALDI-TOF • - Matrix-assisted laser desorptionionization time-of-flight • - Se describió hace 30 años • Se diseñó para analizar biomoléculas • uso reciente para la identificación de microorganismos • Técnica: • Se emplea un emisor de rayos láser que se aplica a una mezcla del microorganismo y una matriz que absorbe la mayoría de la energía emitida • las proteínas del microorganismo quedan ionizadas y son sometidas a una aceleración en un campo eléctrico • son separadas según masa y carga hasta que llegan a un detector • el perfil de proteínas generado se compara con una base de datos y en menos de 10 min. se dispone de la identificación

24. MALDI-TOF Ventajas: - Rapidez - más barato que sistemas habituales - puede identificar la mayoría de microorganismos habituales Uso: -para identificar bacterias y levaduras a partir de colonias - puede utilizarse en frascos de hemocultivos positivos - puede detectar proteínas concretas - proteína fijadora de penicilina PBP2a identificando así staphylcoccus resistentes a oxacilina.

25. Técnicas futuras Multiplex PCR tiempo real Técnica Septifast de Roche. Desarrollada para identificar a partir de sangre del paciente con sospecha de bacteriemia o candidemia hasta 25 microorganismos frecuentes. Aún no comercializado Secuencición del ADN: pirosecuenciación Método rápido que se fundamenta en la detección del pirofosfato liberado durante la síntesis de ADN Permite detectar el polimorfismo de un solo nucleótido se ha empleado: - genotipado de bacerias y virus - reconocer mutaciones de resistencia a antivíricos en VIH - caracterizar bacterias resistentes a antibióticos

26. Técnicas futuras Sistema StaphPlex Diseñado para detectar y amplificar 18 genes de forma simultánea que permiten identificar : -a nivel de especie diferentes estafilococos - identificar resistencia a antibióticos más utilizados

27. GRACIAS