1 / 25

Význam zástavy buněčného cyklu v G2/M pro reparaci radiačního poškození

Význam zástavy buněčného cyklu v G2/M pro reparaci radiačního poškození. Řezáčová M. Vokurková D. Vávrová J. Strategie buňky v odpovědi na poškození DNA. IZ. DSB. Rozpoznání poškození. K omplet ní dvouvláknové zlomy DNA. A k tiva ce mole k ul á r ních mechanism ů.

rivka
Download Presentation

Význam zástavy buněčného cyklu v G2/M pro reparaci radiačního poškození

An Image/Link below is provided (as is) to download presentation Download Policy: Content on the Website is provided to you AS IS for your information and personal use and may not be sold / licensed / shared on other websites without getting consent from its author. Content is provided to you AS IS for your information and personal use only. Download presentation by click this link. While downloading, if for some reason you are not able to download a presentation, the publisher may have deleted the file from their server. During download, if you can't get a presentation, the file might be deleted by the publisher.

E N D

Presentation Transcript

  1. Význam zástavy buněčného cyklu v G2/M pro reparaci radiačního poškození Řezáčová M. Vokurková D. Vávrová J.

  2. Strategie buňky v odpovědi na poškození DNA IZ DSB Rozpoznání poškození Kompletnídvouvláknové zlomy DNA Aktivace molekulárních mechanismů Zástava cyklu, reparace DNA Obrana opravou Potenciálně letální poškození Smrt buňky, apoptóza Obrana eradikací Nestabilita genomu, karcinogeneze

  3. P P p53 Zástava buněčného cyklu po poškození DNA G1/S blok G2/M blok cycE/A cycB P P P P P cdc25A cdc25C P cdk2 • ATM a ATR • Fosforylace p53 • Fosforylace check-point kinas cdk1 cycE/A cycB cdc25C cdc25A cdk2 cdk1 cdc25A Chk1, Chk2 P Chk1, Chk2 Brca1 Reparace DNA DSB Brca1 DSB ATM ATR DNA-PK BRCA1  exprese MDM2 P21 Ser 15 Ser 20 Ser 37 Ser 15 p53 Mdm2 p21 Ser 395 P Mdm2 p21 Mdm2 Mdm2 p53 cycE/A degradace p21 P cycE/A P cdk2 P P cdk2 G1/S blok inaktivace

  4. Reparace dvojitých zlomů DNA • MNR komplex (Mre11/Rad50/Nbs1) • Homologní rekombinace • Pozdní S fáze, G2 fáze • Brca1,2; rad52 • NHEJ – nehomologní spojení konců • Všechny fáze cyklu • Nepřesná • DNA-PKcs, Ku70, Ku80; Ligasa IV; xrcc1; Artemis

  5. C3 p17 p12 P P Dvě základní cesty apoptózy vnější TRAIL-R CD95, TNFR Dap3 Fadd proC9 p18 apoptosom proC8 p10 proC3 bid Apaf-1 C8 bcl-2 bcl-XL mcl1 t-bid bax bak bad cyt c p53 ATM APOPTÓZA p53 vnitřní poškození DNA

  6. P P Vnitřní cesta apoptózy proC9 apoptosom • Poškození DNA • Ionizující záření • UV záření • Cytostatika • Inhibitory HDAC • Jádro -> mitochondrie • Vzestup a fosforylace p53 • Proapoptičtí členové rodiny bcl-2 • Uvolnění cyt c • Apoptosom Apaf-1 bcl-2 bcl-XL mcl1 bax bak bad cyt c p53 ATM p53 poškození DNA

  7. Buňky HL-60 • lidská promyelocytární leukemie • nemají TP-53 - omezená schopnost zástavy cyklu v G1/S • normální exprese bcl-2 • minimální exprese bcl-xL • ztráta schopnosti vyzrání

  8. Reakce buněk HL-60 na ionizující záření • Rychlá interfázová smrt • Časná apoptóza • Dávky nad 10 Gy • Buňky umírají z fáze cyklu kde byly ozářeny • Mitotická smrt • Oddálená apoptóza • Blok buněk v S fázi, G2 fázi • Reparace poškození • Vzestup radiorezistence • D0 = 2,2 Gy • Ozařování v G2 fázi – zvyšuje radiorezistenci buněk • ? Radiosenzibilizující efekt – zkrácení G2 fáze ?

  9. Vliv ionizujícího záření v dávce 20 Gy na změny zastoupení buněk v buněčném cyklu a indukci apoptózy hodnocené podle subG1 vrcholu A=2% A=12% A=48% A=87% G1=44% S= 44% G2=12% G1=47% K 2 4 6 24 Čas po ozáření (h)

  10. Reakce buněk HL-60 na ionizující záření • Rychlá interfázová smrt • Časná apoptóza • Dávky nad 10 Gy • Buňky umírají z fáze cyklu kde byly ozářeny • Mitotická smrt • Oddálená apoptóza • Blok buněk v S fázi, G2 fázi • Reparace poškození • Vzestup radiorezistence • D0 = 2,2 Gy • Ozařování v G2 fázi – zvyšuje radiorezistenci buněk • ? Radiosenzibilizující efekt – zkrácení G2 fáze ?

  11. Vliv ionizujícího záření v dávce 6 Gy na změny zastoupení buněk v buněčném cyklu a indukci apoptózy hodnocené podle subG1 vrcholu K 6 h 24 h Reparace poškození G1=42,2% S =45,4% G2=12,4% G2=85% 48 h 72 h 7 dní A = 62% A

  12. Dávkový příkon Ozáření γ zářením • S vysokým dávkovým příkonem • HDR=0.6 Gy/min • 1 m od zdroje • Laboratorní teplota • Řádově minuty • S nízkým dávkovým příkonem • LDR=3.9 mGy/min • Ozařování v termostatu při 37oC • Řádově hodiny

  13. Vliv ozáření s nízkým dávkovým příkonem na indukci G2 fáze a apoptózy při ukončení ozařování dávkou 1-12 Gy. Již po dávce 2,5 Gy je většina buněk v G2 fázi buněčného cyklu. 1 Gy 2,5 Gy 6 Gy 56,4 72 14,2 K 0,3 3 0,4 8 Gy 10 Gy 12 Gy 13 2 80 84 90 C 9 7 7

  14. Vliv dávkového příkonu na hodnotu D0 Hnědá - HDR D0=2.2 Gy Černá - LDR D0= 3.7 Gy

  15. Srovnání změn buněčného cyklu po ozáření dávkou 10 Gy nízkým a vysokým dávkovým příkonem čas od počátku ozařování(h) 41 h 89h 161h HDR 10Gy 78 73 67 Kontrola G 2=10% Absolutně letální LDR 10Gy G 2=73% 61 Kultura přežívá G1=42,2% S =45,4% G2=12,4% 9 8 Konec ozařování

  16. Ozáření buněk HL-60 γ zářením s nízkým dávkovým příkonem Bb ozařovány především v G2 fázi Lepší reparace poškození Vyšší D0 – buňky jsou k tomuto typu ozáření méně citlivé

  17. Kofein působí jako inhibitor ATM V naší práci jsme sledovali efekt inhibitoru kinasy ATMkofeinu na radiosenzibilizaci buněk HL-60 po ozáření γ zářením • S vysokým dávkovým příkonem • HDR=0.6 Gy/min • S nízkým dávkovým příkonem • LDR=3.9 mGy/min (1 Gy za 4 h)

  18. Kofein - inhibitor ATM kinasy G2/M blok Kofein (Sigma-Aldrich) byl aplikován do kultivačního média 30 min před ozářením, výsledná koncentrace 2 mM cycB P P P cdc25A cdc25C P cdk1 cycB cdc25C cdc25A cdk1 cdc25A Chk1, Chk2 P Chk1, Chk2 DSB ATM ATR

  19. Vliv ozáření dávkou 6 Gy(HDR) v přítomnosti / nepřítomnosti kofeinu na fosforylaci CHK1 kinasy na serinu 317 30 min 2 h 4 h 6 h 1 h CCf - Cf + Cf - Cf + Cf - Cf + Cf - Cf + Cf - Cf + Chk1 Vliv ozáření dávkou 6 Gy(HDR) v přítomnosti / nepřítomnosti kofeinu na Cdc25A fosfatasu 30 min 1 h 2 h 4 h 6 h CCf - Cf + Cf - Cf + Cf - Cf + Cf - Cf + Cf - Cf + Cdc25A

  20. Vliv přítomnosti 2mM kofeinu na změny buněčného cyklu a indukci apoptózy po ozáření dávkou 6 Gy Vysoký dávkový příkon 48 43 32 46 6 Gy 20 14 2 6 Potlačení G2bloku Druhá vlna apoptózy 44 41 35 38 38 6 Gy + kofein 29 22 10 1 2 3 4 5 6 7 8 Dny po ozáření The figure correlates cell-cycle progress and apoptosis induction (subG1peak) of HL-60 cells irradiated with dose 6 Gy and cells incubated with 2 mM caffeine. Caffeine was added to culture 30 minutes prior irradiation and washed out 72 hours after irradiation. At only irradiated group apoptosis induction maximum is 72 hours after irradiation. Caffeine application abrogates G2 phase arrest caused by irradiation and induces apoptosis 144 – 192 hours after irradiation, when irradiation itself already does not induce apoptosis.

  21. Vliv přítomnosti 2mM kofeinu na změny buněčného cyklu a indukci apoptózy po ozáření dávkou 6 Gy Nízký dávkový příkon 33 23 6 Gy 3.9 mGy/ 1min 16 16 7 3 4 2 G2 blok APOPTÓZA 36 39 37 26 36 6 Gy 3.9 mGy/ 1min +caffeine 33 9 3 1 2 3 4 5 6 7 8 Dny od počátku ozařování

  22. Vliv 2 mM kofeinu na procento buněk v G2/M fázi po ozáření dávkou 6 Gy

  23. Vliv přítomnosti kofeinu na dávku D0 HDR D0=2.2 Gy bez kofeinu D0=1.5 Gy s kofeinem LDR D0=3.7 Gy bez kofeinu D0=2.2 Gy s kofeinem

  24. ZÁVĚR • Kofeinsnižuje aktivační fosforylaci Chk1 na serinu 317 1-2 hod po ozáření • Kofeinzvyšuje množství Cdc25A 1-2 hod po ozáření • Tímto kofeinzabraňuje zástavě buněčného cyklu v G2/M fázi • Testem klonogenity lze prokázat silný radiosenzibilizační efekt kofeinu u ozařování s vysokým i nízkým dávkovým příkonem • Buňky ozařované v přítomnosti kofeinu prodělávají druhou vlnu pozdní apoptózy za 6-8 dní po ozáření

  25. Apoptosis – opadávající listy - Kerr, Wyllie a Currie 1972 Děkuji Vám za pozornost a přeji hezký den!

More Related