Enzymologie

1. Enzymologie Inhibition enzymatique

2. Prof. Jeffrey W. Keillor • courriel : jw.keillor@umontreal.ca • site-web : http://www.esi.umontreal.ca/~keillorj/ • tél : 343-6219 • local : F-516 • période de disponibilité : par rendez-vous • notes de cours et diapos disponibles sur ma page web

3. Inhibition enzymatique • inactivation d’une enzyme (ralentissement de la réaction enzymatique) par la liaison d’une petite molécule • différente que la dénaturation

4. Types d’inhibition • réversible • compétitive • incompétitive • noncompétitive • irréversible • par marqueur d’affinité • par inhibition suicide

5. Inhibition compétitive • la liaison de l’inhibiteur, à l’enzyme libre, empêche la liaison du substrat

6. Inhibition compétitive alternative • la liaison de l’inhibiteur, près du site actif, empêche la liaison du substrat par encombrement stérique • la liaison de l’inhibiteur, près du site actif, induit un changement conformationnel qui empêche la liaison du substrat

7. l’oxaloacétate est aussi un inhibiteur compétitif: HO2C-CO-CH2-CO2H Exemple de l’inhibition compétitive • l’acide malonique ressemble à l’acide succinique et inhibe la déhydrogénase de succinate lors de sa liaison :

8. J. Biol.Chem. (2006) 281, 5965-5972.

9. Équations pour l’inhibition comp. • conservation de masse : [E]0 = [E] + [E•S] + [E•I] • substitution en fonction de E•S : • état stationnaire : • constante d’inhibition : KM augmente

10. Graphique d’inhibition compétitive

11. lignes se croisent sur l’axe-y (1/Vmax) Graphique d’inhibition compétitive

12. lignes se croisent sur l’axe-y (Vmax) Graphique d’inhibition compétitive

13. ou les pentes LB (KM/Vmax) Détermination de Ki (compétitive) • équation pour l’augmentation de KM :

14. Équation pour IC50 (compétitive) • équations de vitesse lorsque [Icomp] = IC50 : N.B. : IC50 > Ki

15. ne mène pas aux produits Inhibition incompétitive • l’inhibiteur est lié par le complexe E•S

16. ne mène pas aux produits Exemple de l’inhibition incompétitive • inhibition de la phosphatase alkaline par la L-phénylalanine:

17. J. Mol. Biol. (2005) 350, 441–451

18. Équations pour l’inhibition incomp. • conservation de masse : [E]0 = [E] + [E•S] + [E•S•I] • substitution en fonction de E•S : • état stationnaire : • constante d’inhibition : [E]0 = [E•S] + + KM et Vmax diminuent

19. Graphique d’inhibition incompétitive

20. lignes parallèles Graphique d’inhibition incompétitive

21. lignes se croisent sur l’axe-x (Vmax/KM) Graphique d’inhibition incompétitive

22. ou bien 1/KM Détermination de Ki (incompétitive) • équation pour la diminution de Vmax :

23. Équation pour IC50 (incompétitive) • équations de vitesse lorsque [Iincomp] = IC50 : N.B. : IC50 > Ki

24. ne mène pas aux produits Inhibition non-compétitive • l’inhibiteur est lié par l’enzyme libre et par le complexe E•S

25. ne mène pas aux produits Exemple de l’inhibition non-comp. • inhibition de la bisphosphatase de fructose par le AMP :

26. Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1994) 91, 12482-12486

27. Équations pour l’inhibition noncomp. • conservation de masse : [E]0 = [E] + [E•S] + [E•S•I]+ [E•I] • substitution en fonction de E•S : • état stationnaire, constantes d’inhibition (Ki et Ki') Vmax diminue; KM peut augmenter ou diminuer

28. Inhibition non-compétitive simple • l’affinité de l’inhibiteur est indépendante de la présence de substrat (i.e. Ki = Ki') • KM n’est pas affecté • Vmax est diminué par le facteur de

29. Graphique d’inhibition non-compétitive simple

30. lignes se croisent sur l’axe-x (-1/KM) Graphique d’inhibition non-compétitive simple

31. lignes parallèles Graphique d’inhibition non-compétitive simple

32. Détermination de Ki (non-compétitive simple) • équation pour la diminution de Vmax :

33. Inhibition non-compétitive mixte • l’affinité de l’inhibiteur dépend de la présence de substrat (i.e. KiKi') • Vmax est toujours diminué par le facteur de • KM est affecté selon Ki et Ki'

34. lignes se croisent entre les axes Inhibition non-compétitive mixte • lorsque Ki < Ki', KM augmente et l’inhibition ressemble à l’inhibition compétitive :

35. lignes se croisent en-dessous l’axe-x Inhibition non-compétitive mixte • lorsque Ki > Ki', KM diminue et l’inhibition ressemble à l’inhibition incompétitive :

36. Détermination de Ki' (non-compétitive mixte) • équation pour la diminution de Vmax : ' '

37. Détermination de Ki (non-compétitive mixte) • équation pour la variation de KM :

38. Équation pour IC50 (non-comp. simple) • équations de vitesse lorsque [Inoncomp] = IC50 : N.B. : seulement Vmax est affecté par I; cet effet est indépendant de [S]

39. Graphiques de Dixon • façon alternative pour déterminer la valeur de Ki en faisant un graphique de 1/v vs [I] • pour l’inhibition compétitive et non- compétitive simple, les lignes se crosient où [I] = -Ki • pour inhibition incompétitive, les lignes sont parallèles et c’est impossible de mesurer la valeur de Ki de cette façon

40. lignes se croisent où [I] = -Ki Graphique de Dixon (compétitive)

41. lignes se croisent où [I] = -Ki Graphique de Dixon (non-comp. simple)

42. lignes ne se croisent pas Graphique de Dixon (incomp.)

43. Mécanisme d’inhibition • le mode d’inhibition peut donner des informations sur le mécanisme d’inhibition • faisons l’analyse cinétique détaillée du schéma suivant :

44. Mécanisme d’inhibition • état stationnaire pour E'•S : • état stationnaire pour E' : • alors : • donc : • vitesse : v = k7 [E'S] • conservation de masse : [E]T = [E] + [E'] + [E'•S] + [E • I] • cste d’inhibition :

45. Vmax diminue; KM peut augmenter ou diminuer Mécanisme d’inhibition • équation Michaelis-Menten pour inhibition : • d’où vient : • et : inhibition non-compétitive!!

46. Mécanisme d’inhibition • l’inhibiteur ne se lie pas à la forme de l’enzyme qui lie le substrat; donc, pas compétitif • l’inhibiteur ne se lie pas au complexe enzyme-substrat; donc, pas incompétitif • donc, l’inhibiteur est non-compétitif • on voit que les profils d’inhibition ne sont pas exclusifs pour un seul type de mécanisme

47. Inhibition de réaction avec multiples substrats • pour élucider un mécanisme enzymatique, on peut étudier l’effet cinétique de la variation des : • substrats : 1/v vs 1/[S1] en fonction de [S2]; 1/v vs 1/[S2] en fonction de [S1]… • produits : 1/v vs 1/[S1] en fonction de [P1], [P2]; 1/v vs 1/[S2] en fonction de [P1], [P2]… • inhibiteurs : 1/v vs 1/[S1] en fonction de [I1], [I2]; 1/v vs 1/[S1] en fonction de [I1], [I2]… • le patron d’inhibition observée aide surtout à déterminer l’ordre de liaison des substrats

48. Inhibition d’un mécanisme ordonné • par exemple, pour le schéma ci-dessus : • I1 est compétitif avec B et incompétitif avec A • I1 lie la même forme de l’enzyme que B, et se lie après A • I2 est compétitif avec A et non-compétitif avec B • I2 lie la même forme de l’enzyme que A, et se lie avant B

49. Règles de Cleland • dans le cas où I se lie à E avant S, l’inhibition est : • compétitive lorsque : i)I et S lient la même forme de E, ou ii) I et S se lient à deux formes de E en équilibre rapide • incompétitive lorsque :I et S se lient à des formes différentes de E séparées par une étape irréversible • non-compétitive lorsque :I et S se lient à des formes différentes de E reliées par une réaction réversible ou une séquence de réactions réversibles

50. Règles de Cleland • dans le cas où I se lie à E après S, l’inhibition est : • incompétitive - toujours.