1 / 41

Enzymologie

Enzymologie. Ivo Šafařík, Mirka Šafaříková biomagnetický výzkum a technologie ivosaf@yahoo.com ivosaf@seznam.cz. Kde najdu informace?. http://www.usbe.cas.cz/people/safarik/ Stránky v češtině Přednášky na Jihočeské universitě v Českých Budějovicích Enzymologie

munin
Download Presentation

Enzymologie

An Image/Link below is provided (as is) to download presentation Download Policy: Content on the Website is provided to you AS IS for your information and personal use and may not be sold / licensed / shared on other websites without getting consent from its author. Content is provided to you AS IS for your information and personal use only. Download presentation by click this link. While downloading, if for some reason you are not able to download a presentation, the publisher may have deleted the file from their server. During download, if you can't get a presentation, the file might be deleted by the publisher.

E N D

Presentation Transcript


  1. Enzymologie Ivo Šafařík, Mirka Šafaříková biomagnetický výzkum a technologie ivosaf@yahoo.com ivosaf@seznam.cz

  2. Kde najdu informace? http://www.usbe.cas.cz/people/safarik/ • Stránky v češtině • Přednášky na Jihočeské universitě v Českých Budějovicích • Enzymologie - Přednášky v PowerPointu, verze 2002 a 1995

  3. Enzymologie Nauka o biokatalýze a biokatalyzátorech

  4. Enzymologie • studium struktury enzymů • studium kinetiky enzymových reakcí • studium reakčních mechanismů • studium forem a lokalizace enzymů • studium vztahu enzymů k patologii organismů • praktické využití enzymů • příprava a studium umělých enzymů

  5. Co nás čeká ??? 1. Struktura bílkovin 2. Klasifikace a názvosloví enzymů, charakterizace jednotl. tříd enzymů 3. Koenzymy, jejich klasifikace, charakterizace, modifikace, využití 4. Struktura a funkce enzymů, mechanismy enzymových reakcí 5. Kinetika enzymových reakcí. Kinetika inhibice enzymových reakcí 6. Charakterizaci enzymů (MW, IEP, KM, pH a teplotní optimum.... 7. Metody pro stanovení enzymových aktivit 8. Inhibitory a aktivátory. Klasifikace, charakterizace, využití 9. Upstream processing 10. Downstream processing 11. Imobilizace a stabilizace enzymů 12. Aplikace enzymů 13. Nejnovější poznatky v enzymologii

  6. Katalýza • Katalýza - Berzelius 1838 Katalyzátor • látky urychlující chemické reakce • nemění rovnováhu chemických reakcí • snižují aktivační energii

  7. Biokatalyzátory • globulární bílkoviny • RNA - CZECH a ALTMAN (1986) • jednoduchá x složená bílkovina • více než 3000 enzymů v buňce • enzymy jsou druhově specifické • velmi účinné (až 5.104 molekul/s) • specifita reakční, substrátová • aktivní za mírných podmínek • možnost regulace • netoxické

  8. Historie poznání enzymů • 18 století: trávicí účinek žaludeční šťávy • 1878: KŰHNE zavedl název ENZYM (En Zyme - v kvasnicích) • 1897 - BUCHNER - extrakt kvasinek katalyzuje kvašení • 1926 - SUMNER - bílkovinná povaha enzymů - ureasa

  9. Enzymové technologie • Použití isolovaných enzymů, enzymových komplexů a buněk • Isolace enzymů • Imobilizace enzymů, enzymových komplexů a buněk • Enzymové procesy v nevodných systémech, micelách, dvoufázových systémech

  10. Technické enzymy • Proteasy (bakteriální) • Syřidla • Glukoamylasy • Alfa-amylasy • Glukosaisomerasy

  11. Enzymy jsou proteiny • Proteiny jsou složeny z 20 kódovaných aminokyselin • L-enantiomery

  12. R představuje jeden z 20 různých typů postranních řetězců Hlavní řetězec je neměnný - základ peptidové vazby, existence dvou enantiomerních konfigurací, tvorba vodíkových můstků Chemická struktura aminokyselin

  13. Hlavní řetězec aminokyselin – vliv pH • přifysiologickém pH mají volné aminokyseliny charakter amfiontu(“zwitterion”) • pK COOH skupiny je mezi 1.7-2.6 • pK NH2skupiny je mezi 9.0-10.8 • pI = 0.5 (pK1 + pK2) pH 1 pH 7 pH 11

  14. aminokyseliny - optická aktivita • alfa atom uhlíku je asymetrickýpro 19 z 20 běžných aminokyselin (výjimkou je glycin,kde R = H). 19 aminokyselin se vyskytuje jako L-isomer. D-aminokyseliny jsou vzácné. L-isomer rovina souměrnosti D-isomer (vzácný) Threonin a isoleucin obsahují dva asymetické atomy uhlíku existují čtyři stereoisomerní formy

  15. Klasifikace aminokyselin podle postranních řetězců • hydrofobní • hydrofilní • - neutrální • - kyselé • - zásadité

  16. Přehled aminokyselin • 6 hydrofilních neutrálních postranních řetězců.Všechnyobsahují =O, O-H nebo N-H skupiny které tvoří vodíkové můstky. • 2 hydrofilní kyselé postranní řetězce.Obsahují karboxylové skupiny COO-s negativním nábojem při fysiologickém pH. pK 3.9 (aspartát) and 4.3 (glutamát). • 3 hydrofilní basické postranní řetězce.Obsahují N-H skupiny (protonované u lysinu a argininu přifysiologickém pH). • 9 hydrofobních postranních řetězců.Všechny obsahují zejména C-H vazby které málo interagují s molekulami vody. Jsou většinou uvnitř molekuly proteinu.

  17. Tvoří vodíkové můstky. Obvykle na povrchu proteinů. Šest hydrofilních neutrálních aminokyselin Serine Threonine Tyrosine Asparagine Glutamine Cysteine Ser, S Thr, T Tyr, Y Asn, N Gln, Q Cys, C

  18. Tvoří vodíkové můstky. Obsahují ionizovatelné skupiny. Tři basické aminokyseliny Dvěkyselé aminokyseliny Aspartate Glutamate Asp, D Glu, E Lysine Arginine Histidine Lys, K Arg, R His, H

  19. Histidin • pK cca 6 při fysiologickém pH imidazolový kruh může fungovat jako donor i akceptor protonů • Imidazolový kruh zároveň působí jako nukleofil • Histidin se vyskytuje v aktivním místě velké řady enzymů

  20. Devět hydrofobních aminokyselin Ponořeny v proteinech Netvoří vodíkové můstky Glycine, Gly, G Alanine, Ala, A Valine, Val, V Leucine, Leu, L Isoleucine, Ile, I Netvoří vodíkové můstky Methionine, Met, M Phenylalanine, Phe, F Tryptophan, Trp, W Proline, Pro, P (imino kyselina)

  21. Tvorba peptidové vazby Peptidová vazba spojuje aminokyseliny vede ke vzniku proteinů Polypeptidický řetězec vždy začíná na N-konci (aminokyselinový zbytek č. 1; volná NH3+skupina je nalevo) a končí na C-konci (volná COO-skupina napravo).

  22. Peptidická vazba je rigidní • Mezi sousedními postranními řetězci jsou třivazby. • Jedna z vazeb vykazuje částečně násobný charakter a nemůže rotovat - je rigidní. • Ostatní dvě vazby mohou rotovat. • Tyto skutečnosti umožňují vznik sekundárních struktur(a-helix,b-struktury).

  23. Čtyřiúrovně strukturybílkovin Primární struktura (chemická):pořadí aminokyselin v řetězci, další detaily (umístění disulfidických můstků, prosthetickýchskupin, glykosylace). Sekundární struktura:vzájemný prostorový vztah sousedních nebo blízkých aminokyselin. Typické struktury: a-helix, b-struktura. Stabilizace pouze vodíkovými můstky. Terciární struktura:vzájemný prostorový vztah vzdálených částí řetězce. Stabilisace vodíkovými můstky, iontovými interakcemi, hydrofobními interakcemi a disulfidickýmimůstky. Kvartérní struktura:prostorové uspořádání molekulových podjednotek, které tvoří celistvé molekuly (např: 2a a 2břetězce hemoglobinu)

  24. Bílkoviny:a- helix Vlastnosti: (1) „Tyčkovitý“ tvar, postranní řetězce směřují ven (2) Všechny C=O a N-H skupinyz peptidických vazeb vytváří vodíkové můstky (3) Vodíkové můstky jsou rovnoběžné s osou helixu (4) 3.6 aminokyselinového zbytku na jednu otočku (5) Pravotočivý směr díky přítomnosti L-aminokyselin

  25. Bílkoviny: α-helix

  26. Bílkoviny: β-struktury Maximálně „natažený“ proteinový řetězec. • Vlastnosti: • (1) Řetězec je natažen, postranní řetězce směřují střídavě nahoru a dolů • (2) Všechny C=O & N-H skupiny z peptidických vazeb vytváří vodíkové můstky • (3) Vodíkové můstky se vytváří mezi jednotlivými řetězci a jsou kolmé na řetězce • (4) Paralelní struktury: N-konce jsou na téže straně • (5) Antiparalelní struktury: N-konce jsou na opačných stranách

  27. Bílkoviny: β-struktury

  28. Bílkoviny: β-struktury

  29. Supersekundární struktura

  30. Intramolekulární vazby

  31. Terciární struktura - myoglobin

  32. Kvartérní strukturaglutaminsynthetasa12 podjednotek

  33. Aminokyselinové složení proteinů • Úplná hydrolýza proteinu (6 M HCl, 110 °C, 20 – 72 hod.) • Dělení aminokyselin ionexovou chromatografií • HPLC na reverzních fázích • Fotometrická detekce po reakci AK s ninhydrinem • Automatické analyzátory aminokyselin

  34. Počet polypeptidických řetězců • Stanovení počtu N- a C- koncových aminokyselin • Značení α-amino skupiny (např. 2,4-dinitrofluorbenzenem)  hydrolýza proteinu  detekce značených aminokyselin • Odštěpení aminokyselin z C-konce karboxypeptidasou • Podmínka: řetězce mají různé koncové aminokyseliny!

  35. Určení N-koncové aminokyseliny

  36. Přerušení disulfidických můstků • Tvořeny cysteinem • Uvolnění jednotlivých řetězců • Oxidace kyselinou permravenčí na kys. cysteovou

  37. Přerušení disulfidických můstků • Redukce merkaptoethanolem a následující karboxymethylace kyselinou jodoctovou karboxymethylcystein

  38. Stanovení primární struktury • Postupné odbourávání od N-konce • Edmanův postup • Použití fenylisothiokyanátu • Možno analysovat peptidy do 60 - 70 aminokyselin

  39. Edmanovo odbourávání

  40. Štěpení dlouhých řetězců • Specifické proteasy (trypsin, chymotrypsin, pepsin, thermolysin...) • Chemické štěpení (bromkyan štěpí za methioninem) • Následná separace štěpů chromatografickými a elektroforetickými metodami • Nutná dvě nezávislá štěpení (metoda překrývajících se štěpů)

  41. Kdo byl první??? • Ribonukleasa (1960) • F. Sanger – Nobelova cena

More Related