高效液相色谱

1. 高效液相色谱 第一节 HPLC 概述 第二节 HPLC 仪器 第三节 HPLC 流动相和固定相 第四节 HPLC 主要类型 第五节 HPLC 应用

2. 高效液相色谱法：以气相色谱为基础，在经典液相色谱实验和技术基础上建立的一种液相色谱法高效液相色谱法：以气相色谱为基础，在经典液相色谱实验和技术基础上建立的一种液相色谱法 第一节 概述 一、HPLC与经典LC比较 二、HPLC与GC比较 三、特点

3. 一、HPLC与经典LC比较 主要区别：固定相差别，输液设备和检测手段

4. 相同：兼具分离和分析功能，均可以在线检测 差别：分析对象和流动相的差别 二、HPLC与GC比较 1．分析对象 GC： 能气化、热稳定性好、且沸点较低的样品；占有机物的20% HPLC：不受样品挥发性和热稳定性的限制，分子量大、难气化、热稳定性差及离子型样品均可检测；占有机物的80%

5. 2．流动相差别 GC：流动相为惰性气体 组分与流动相无亲合作用力，只与固定相作用 HPLC：流动相为非惰性液体 流动相与组分间有亲合作用力，为提高柱的选择性、 改善分离度增加了因素，对分离起很大作用 流动相种类较多，选择余地广 流动相极性和pH值的选择也对分离起到重要作用 选用不同比例的两种或两种以上液体作为流动相 可以增大分离选择性 3．操作条件差别 GC：加温操作 HPLC：室温；高压（液体粘度大，峰展宽小）

6. 特点：“三高”“一快”“一广” 三、HPLC的特点 高柱效——n=104片/米，柱效高 高灵敏度 高选择性 分析速度快 应用范围广（可分析80%有机化合物）

7. 高效液相色谱仪： 高压输液系统 进样系统 分离系统 检测系统 记录系统 第二节 高效液相色谱仪 工作过程图

8. 1高压输液系统 （1）溶剂贮存器 溶剂贮存器一般由玻璃、不锈钢或氟塑料制成，容量为1到2L。用来贮存足够数量，符合要求的流动相 （2）高压泵 1）对泵的要求：输出压力高、流量范围大、流量恒定、无脉动，流量精度和重复性为0.5%左右。此外，还应耐腐蚀，密封性好

9. 2）恒流泵是给出恒定流量的泵;优点是流量不受流动相粘度和色谱体系中其余部分阻力变化的影响、易于调节控制，死体积小，便于清洗和更换流动相，很适于梯度洗脱;缺点是输出有脉冲波动,为减小脉动，常用两个泵头并加脉冲阻尼器2）恒流泵是给出恒定流量的泵;优点是流量不受流动相粘度和色谱体系中其余部分阻力变化的影响、易于调节控制，死体积小，便于清洗和更换流动相，很适于梯度洗脱;缺点是输出有脉冲波动,为减小脉动，常用两个泵头并加脉冲阻尼器

10. 3）恒压泵是保持输出压力恒定，优点：能供给无脉动的输出，并能提供大的输出流量，缺点：液缸体积大，更换流动相不方便，不适用于频繁更换流动相的选择合适溶剂的实验，也不便于梯度洗脱；恒压泵通常用于匀浆法装填色谱柱3）恒压泵是保持输出压力恒定，优点：能供给无脉动的输出，并能提供大的输出流量，缺点：液缸体积大，更换流动相不方便，不适用于频繁更换流动相的选择合适溶剂的实验，也不便于梯度洗脱；恒压泵通常用于匀浆法装填色谱柱 （3）在线脱气装置 在线脱气装置用于脱去流动相中的溶解气体，流动相先经过脱气装置再输送到色谱柱，脱气不好时有气泡，导致流动相流速不稳定，造成基线漂移，噪音增加,也可采用超声脱气和真空脱气

11. （4）梯度淋洗装置 在分离过程中使两种或两种以上不同极性的溶剂按一定程序连续改变它们之间的比例，从而使流动相的强度、极性、pH值或离子强度相应地变化，达到提高分离效果、缩短分析时间的目的 A B C B A C

12. 梯度洗脱装置有两类： （1）低压梯度，又称外梯度，它是先混合后加压，即在常压下按一定的程序预先将溶剂混合，然后再用泵加压输入色谱柱，优点：只需一台泵，价廉 （2）高压梯度，又称内梯度，它是先加压后混合，即用几台泵分别将不同溶剂加压，然后按程序规定的流量比例输入混合室混合，再进入色谱柱，优点：能得到任意类型的梯度曲线，易于自动化，但至少需要两台泵，价格较高

13. 2．进样装置 1）隔膜注射进样：使用微量注射器进样，装置简单、死体积小。但进样量小且重现性差 2）高压定量进样阀：目前最常用的为六通阀。由于进样量可由样品管控制，因此进样准确，重复性好

15. 3．色谱柱 （1）概述：目前常用的标准柱型是内径为4.6或3.9mm，长度为15－30cm的直形不锈钢柱，填料颗粒度为5－10μm，柱效以理论塔板数计大约为5000－20000。目前液相色谱柱发展的趋势是减小填料的颗粒度（3－5μm）和减小柱径，以提高柱效，但是这对仪器和技术的要求将更高

16. 液相色谱柱的柱效不仅取决于柱填料的性能，而且和装柱技术关系极大。HPLC的装柱是一项技术性很强的工作，通常都是由专业人员操作，一般实验室不能自行装柱液相色谱柱的柱效不仅取决于柱填料的性能，而且和装柱技术关系极大。HPLC的装柱是一项技术性很强的工作，通常都是由专业人员操作，一般实验室不能自行装柱

17. （2）柱的填充 1）干法：填料粒度大于20µm，可用和气相色谱柱相同的干法装柱 2）湿法：填料粒度小于20µm，由于微小颗粒表面存在着局部电荷，具有很高的表面能，因此在干燥时倾向于颗粒间的相互聚集，产生宽的颗粒范围并粘附于管壁，不利于获得高的柱效 具体做法：以一合适的溶剂或混合溶剂作为分散介质，使填料颗粒在介质中高度分散，形成匀桨，然后在高压泵作用下，快速将其压入装有洗脱液的色谱柱内，经冲洗后，即可备用

18. （3）GC, HPLC色谱柱的比较

19. 4．检测器 （1）对检测器的要求：灵敏度高，重复性好、线性范围宽、死体积小以及对温度和流量的变化不敏感等 （2）检测器的类型：一类是溶质性检测器，它仅对被分离组分的物理或物理化学特性有响应，属于此类检测器的有紫外、荧光、电化学检测器等；另一类是总体检测器，它对试样和洗脱液总的物理和化学性质响应，属于此类检测器有示差折光检测器等

20. 1）紫外光度检测器 原理：待测组分对特定波长的紫外光的选择性吸收，组分浓度与吸光度的关系遵守比尔定律 紫外－可见光检测器有固定波长和可变波长两类，光源波长是固定的，通常用汞灯的254nm或280nm谱线

21. 可调波长的紫外可见光检测器实际上就是装有流通池的紫外可见分光光度计，不仅可以选择适当的检测波长，还可以记录组分的紫外吸收光谱，即当组分通过流通池时，短时间中断液流快速扫描（停流扫描），可以得到组分的紫外光谱图，为定性分析提供信息，或据此选择最佳检测波长可调波长的紫外可见光检测器实际上就是装有流通池的紫外可见分光光度计，不仅可以选择适当的检测波长，还可以记录组分的紫外吸收光谱，即当组分通过流通池时，短时间中断液流快速扫描（停流扫描），可以得到组分的紫外光谱图，为定性分析提供信息，或据此选择最佳检测波长

22. 紫外光度检测器特点 灵敏度高；应用范围广；流通池可做的很小（1mm×10mm，容积8μL）；对流动相的流速和温度变化不敏感；波长可选，易于操作；可用于梯度洗脱；溶剂必须能让所选择的光透过，即所选波长不能小于溶剂的最低使用波长

23. 紫外光电二极管阵列检测器原理 采用光电二极管阵列作检测元件，阵列由211～512个光电二极管组成（二极管越多，分辨率越高），每一个二极管测量一段波长的光谱。具有组分特征吸收的全部波长经光栅分光后同时被检测

25. 紫外光电二极管阵列检测器

26. 紫外光电二极管阵列检测器特点 同时获得信号强度值是保留时间和波长的函数，即获得三维色谱图，同时获得多种信息，使得每个组分在整个波长范围内的光谱信息大大增加，可迅速获得最佳选择性和灵敏度的波长

27. 2）荧光检测器 原理：紫外光照射样品，组分受到激发跃迁至激发态，返回基态的过程中发射的谱线，谱线强度与组分含量成正比

28. 荧光检测器的特点 优点：灵敏度高（比紫外检测器的灵敏度高2个数量级）、选择性好（不同物质所产生荧光波长不同）、样品用量少 缺点：应用范围小，只能用于在紫外光下能产生荧光的物质或能制成荧光衍生物的物质，对于不发荧光的物质不能检测，而且线性范围较小，通常仅约为1000 应用：荧光检测器常用于酶、甾族化合物、维生素、氨基酸以及某些药物的分析

29. 3）示差折光检测器 原理：利用两束相同角度的光照射流动相和样品+流动相，二者对光的折射率不同，折射率之差即表示试样在流动相中的浓度

30. 由于每种物质几乎都有各自不同的折射率，因此都可以用示差折光检测器来检测，示差折光检测器是一种通用型检测器，对所用物质都有响应，如同气相色谱仪的热导检测器。由于每种物质几乎都有各自不同的折射率，因此都可以用示差折光检测器来检测，示差折光检测器是一种通用型检测器，对所用物质都有响应，如同气相色谱仪的热导检测器。 其主要缺点是:(1)灵敏度较低;(2)对温度和流量变化敏感，必须精确控制温度和流量;(3)不能用于梯度洗脱。一般用于无紫外吸收的物质。

31. 4）电导检测器 原理：电导检测器是离子色谱中应用最多的检测器，其主要部件是电导池，检测原理是溶液电导与离子浓度有关，根据电导的变化来测定离子浓度 特点：电导检测器对分子不响应，对离子则是通用型的，它对温度和流量敏感，因此必须严格控制温度和流量，并且不适用于梯度洗脱

32. 5. 蒸发光散射检测器 检测原理：从色谱柱中流出的流动相进入雾化室,在雾化气体作用下,样品组分生成气溶胶，之后溶剂逐渐蒸发，形成只含溶质的微小颗粒，微小颗粒在强光照射下产生光散射, 散射光与组分量成正比

33. 蒸发光散射检测器是质量型、通用检测器，特别适合无紫外吸收的样品，主要应用于糖类、高级脂肪酸、磷脂、维生素、甾类等化合物蒸发光散射检测器是质量型、通用检测器，特别适合无紫外吸收的样品，主要应用于糖类、高级脂肪酸、磷脂、维生素、甾类等化合物 使用此检测器条件是组分必须能雾化并且能形成小颗粒,流动相不能含有不挥发的盐类

34. 对流动相的要求 （1）纯度要高，一般用分析纯试剂，必要时还要进一步纯化，使用前要过滤除去微粒以免堵塞，还应除去溶解的气体（称为脱气），以免在柱中或检测器中产生气泡而影响分离和检测 （2）与固定相不互溶、不反应，即不能使用能引起柱效损失或保留特性变化的溶剂，如吸附色谱法的流动相不能含水，硅胶色谱柱不能用碱性溶剂，液液色谱法中流动相应该与固定相互不相溶以免引起固定相流失等 一 流动相 第三节 HPLC流动相和固定相简介

35. （3）溶剂对于试样要有适宜的溶解度，以免试样在柱中沉淀而造成堵塞，更换流动相时必须保证互溶 （4）流动相应与检测器匹配，如使用紫外检测时，流动相本身在检测波长处应当无吸收 （5）尽量使用低粘度的溶剂，如甲醇、乙腈等，可以增加组分的扩散系数，增加传质，提高柱效，同时还能降低色谱柱的阻力

36. 二 固定相 1. 按承受压力分 刚性固体：SiO2为基质，耐压为7.0×108 ~ 1.0×109 Pa。可制成直径、形状和孔隙深度不同的颗粒；主要用于吸附、分配和键合色谱 硬 胶：以聚合物为基质(常用苯乙烯与二乙烯苯交联而成)，耐压上限为3.5×108 Pa, 主要用于离子交换和尺寸排阻色谱

37. 2. 按孔隙深度分 表面多孔型：以实心玻璃珠为基体，在基体表面覆盖一层多孔活性材料(如硅胶、氧化铝、离子交换剂、分子筛、聚酰胺等)。表面多孔型固定相的颗粒大(易装柱)、多孔层厚度小且孔浅(渗透性好，出峰快)；但交换容量小；适于常规分离分析 全多孔型：全部由硅胶或氧化铝微粒聚集而成，因颗粒极细，因而孔径小、传质快、柱效高；特别适于复杂混合物的分离

39. 第四节 HPLC主要类型 • 吸附色谱 液一固吸附色谱是以固体吸附剂为固定相，吸附剂通常是多孔的固体颗粒物质，在它们的表面存在吸附中心 1 原理 各组分与流动相分子争夺吸附剂表面活性中心，利用吸附剂对不同组分的吸附能力差异实现分离

40. 2 固定相 一般为吸附活性强弱不等的吸附剂：极性吸附剂包括硅胶、氧化铝、氧化镁、硅酸镁、分子筛及聚酰胺等，非极性吸附剂最常见的是活性炭 极性吸附剂可进一步分为酸性吸附剂和碱性吸附剂。酸性吸附剂包括硅胶和硅酸镁等，适于分离碱，如脂肪胺和芳香胺；碱性吸附剂有氧化铝、氧化镁和聚酰胺等，适于分离酸性溶质，如酚、羧酸和吡咯衍生物等

41. 3 流动相 在吸附色谱中，选择流动相主要考虑溶剂的极性，选择原则是：极性大的试样需要用极性强的洗脱剂，极性弱的试样宜用极性较弱的洗脱剂。但是还要考虑固定相的性质，对于强极性的硅胶柱，宜用低极性的溶剂，如烷烃类

42. 4 应用 当组分分子结构与吸附剂表面活性中心的刚性几何结构相适应时易于吸附，从而使吸附色谱成为分离几何异构体的有效手段，如农药异构体分离 ；不同的官能团具有不同的吸附能，因此，吸附色谱可按族分离化合物，石油中烷、烯、芳烃的分离；对于同系物没有选择性，不能用该法分离分子量不同的同系物

43. 二 分配色谱 在液-液色谱中,流动相和固定相都是液体 1 原理 根据各待测物在互不相溶的两溶液中的溶解度不同，因而具有不同的分配系数

44. 2 流动相 流动相必须与固定相不互溶；选择流动相时主要考虑溶剂的极性，然后用实验确定 因此，根据流动相与固定相极性的差别程度，可将液液色谱分为正相分配色谱（流动相极性小于固定相极性，极性小的先流出，适于极性组分分离）和反相分配色谱（流动相极性大于固定相极性，极性大的先流出，适于非极性组分分离）

45. 正相色谱法和反相色谱法的区别如下： 正向色谱法 反向色谱法 固定相 强极性 非极性 流动相弱-中等极性中-强极性 出峰顺序极性弱的组分先出极性强的组分先出 保留值和流动随流动相极性增强 随流动相极性增强 相极性关系保留值变小 保留值变大 适宜分离物质 极性物质 弱极性物质

46. 如何选择合适的流动相？ 例如：在正相液－液色谱法中，可先选中等极性的溶剂为流动相，若组分的保留时间太短，表示溶剂的极性太大；改用极性较弱的溶剂，若组分保留时间太长，则溶剂极性太小，然后再在上述两种溶剂极性之间选择，如此多次实验，最后选定最适宜的溶剂

47. 关于溶剂的极性，可以用Snyder提出的溶剂极性参数P’来表示，P’越大，则溶剂的极性越大，P’值可以从手册上查到，常用溶剂的P’值见下表：关于溶剂的极性，可以用Snyder提出的溶剂极性参数P’来表示，P’越大，则溶剂的极性越大，P’值可以从手册上查到，常用溶剂的P’值见下表：

48. 为了获得合适的溶剂强度，可采用混合溶剂作为流动相，以改善分离效果。混合溶剂的极性参数可以用下式计算： 其中 为纯溶剂的极性参数， 为溶剂A,B…所占的体积分数 显然，改变溶剂的体积比可以改变混合溶剂的极性参数，通常溶剂极性参数应调节到使被分离组分的容量因子k在2～5的最佳范围

49. 如果试样组分的极性范围较大，可采用梯度洗脱，梯度洗脱时，正相色谱法通常逐渐增大流动相中极性溶剂的比例，而反相色谱法与之相反，逐渐增大极性相对较低的甲醇或乙腈的比例

50. 3 固定相 液液色谱的固定相由载体和固定液组成 （1）常用的载体有下列几类： 1）表面多孔型载体（薄壳型微珠载体），由直径为3040m的实心玻璃球和厚度约为12m的多孔性外层所组成 2）全多孔型载体，由硅胶、硅藻土等材料制成，直径3050m的多孔型颗粒 3）全多孔型微粒载体，由nm级的硅胶微粒堆积而成，又称堆积硅珠，这种载体粒度为510m。由于颗粒小，所以柱效高，是目前使用最广泛的一种载体