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Marc Bonneu ESTBB 2008

Les approches protéomiques. Marc Bonneu ESTBB 2008. Plan. 1-Séparation des protéines par électrophorèse 2-Identification des protéines par spectrométrie de masse Carte peptidique Séquençage peptidique 3-Quantification des protéines Comparaison gel 2D Marquage isotopique Label Free

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Marc Bonneu ESTBB 2008

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  1. Les approches protéomiques AEB2011 Marc Bonneu ESTBB 2008

  2. Plan • 1-Séparation des protéines par électrophorèse • 2-Identification des protéines par spectrométrie de masse • Carte peptidique • Séquençage peptidique • 3-Quantification des protéines • Comparaison gel 2D • Marquage isotopique • Label Free • 4-Caractérisation des protéines • Interactions protéine-protéine • Modifications post-traductionnelles

  3. 1-Séparation des protéines par électrophorèse SDS-PAGE • Avantage : • toutes les protéines y compris les protéines membranaires • Inconvénient : • Plusieurs protéines dans la même bande • Les petites protéines migrent toutes ensemble au niveau du front de migration

  4. 1-Séparation des protéines par électrophorèse Tris-Tricine Remplacement de la glycine par un tripeptide de glycine (Tricine) Petites protéines emprisonnées dans des micelles de SDS

  5. 1-Séparation des protéines par électrophorèse IPG/SDS-PAGE pI • Avantages : • Excellente résolution • Les limites : • Protéines majeures • Protéines solubles • 4 < pI <11 • 15 000 Da < PM < 150 000 Da taille

  6. 1-Séparation des protéines par électrophorèse 16-BAC/SDS-PAGE 16-BAC (benzyldimethyl-n-hexadecylammonium chloride) 16-BAC Détergent cationique SDS • Avantages : • Séparation des protéines hydrophobes possible • Les limites : • Résolution réduite

  7. 1-Séparation des protéines par électrophorèse La détection des protéines sur gel 1: 1000 ng/ protéine 2: 500 ng/ protéine 3: 250 ng/ protéine 4: 125 ng/ protéine 5: 62.5 ng/ protéine 6: 31.25 ng/ protéine 7: 15.6 ng/ protéine Coomassie R250 Nitrate d’argent Bleu Colloïdal 1 1 1 1 1 1 2 2 2 2 2 2 3 3 3 3 3 3 4 4 4 4 4 4 5 5 5 5 5 5 6 6 6 6 6 6 7 7 7 7 7 7 Ruthenium 16µl/L SyproRuby ProQ diamond

  8. 1-Séparation des protéines par électrophorèse La détection des protéines sur gel La gamme dynamique est définie comme le rapport du signal maximal mesurable sur le signal minimal mesurable

  9. protéine gène 2-Identification des protéines par spectrométrie de masse Spectromètre de masse : mesure précise du rapport m/z d’un ion H+ Spectromètre de Masse m : masse de l’ion z : valence de l’ion peptide ou protéine ion m/z unité : Thompson Ionisation Analyse en m/z

  10. + + ++ + 2-Identification des protéines par spectrométrie de masse Pourquoi le spectromètre de masse mesure le rapport m/z ? H+ = 1 Da Champ électrostatique Vide suffisant 1000 + 1 = 1001 m = 1000 Da m/z = 1 1000 + 2 = 501 m = 1000 Da m/z = 2 2000 + 1 m = 2000 Da m/z = = 2001 1

  11. 2-Identification des protéines par spectrométrie de masse Comment à partir du rapport m/z on déduit la valeur de la masse ? H+ = 1 Da 501 1000 + 1 2001 = 1001 m/z = 1 1001 1000 + 2 = 501 m/z = 2 2000 + 1 m/z = = 2001 1

  12. 2-Identification des protéines par spectrométrie de masse Comment à partir du rapport m/z on déduit la valeur de la masse ? H+ = 1 Da 501 1000 + 1 2001 = 1001 m/z = 1 1001 1000 + 2 = 501 m/z = 2 2000 + 1 m/z = = 2001 1

  13. 2-Identification des protéines par spectrométrie de masse Comment à partir du rapport m/z on déduit la valeur de la masse ? H+ = 1 Da 501 1000 + 1 2001 = 1001 m/z = 1 1001 1000 + 2 = 501 m/z = 2 2000 + 1 m/z = = 2001 1 Le massif isotopique

  14. 2-Identification des protéines par spectrométrie de masse Comment à partir du rapport m/z on déduit la valeur de la masse ? x12C (x-1) 12C + 1 13C La différence de masse entre deux pics successifs d’un massif isotopique est égale à 1Da (x-2) 12C + 2 13C Le massif isotopique

  15. 2-Identification des protéines par spectrométrie de masse Comment à partir du rapport m/z on déduit la valeur de la masse ? x12C (x-1) 12C + 1 13C La différence de masse entre deux pics successifs d’un massif isotopique est égale à 1Da (x-2) 12C + 2 13C a Th a Th

  16. 2-Identification des protéines par spectrométrie de masse Comment à partir du rapport m/z on déduit la valeur de la masse ? x12C (x-1) 12C + 1 13C La différence de masse entre deux pics successifs d’un massif isotopique est égale à 1Da (x-2) 12C + 2 13C a Th a Th a = 1  z = 1 a = 0.5  z = 2 a = 0.33  z = 3

  17. I m/z I m/z 2-Identification des protéines par spectrométrie de masse Carte peptidique Peptides générés par protéolyse Spectre MS expérimental Protéine à identifier K K R K K R Comparaison Séquences des protéines Peptides générés in silico Spectres MS théoriques LKLLIHGFDSQASDR FGNHGGTK TRFDFEEK YILMNPR THSEIK YILMNPRTHSEIKNPMLKLLIHGFDSQASDRTFGNHGGTKTRFDFEEKMLIYTRNVCWCHGFPITREAESDD

  18. K K R K K R I m/z I m/z 2-Identification des protéines par spectrométrie de masse Séquençage peptidique Protéine Peptides générés par protéolyse Spectre MS expérimental Spectre MS2 expérimental I m/z Comparaison Séquences des protéines Peptides générés in silico Spectres MS2 théoriques LKLLIHGFDSQASDR FGNHGGTK TRFDFEEK YILMNPR THSEIK YILMNPRTHSEIKNPMLKLLIHGFDSQASDRTFGNHGGTKTRFDFEEKMLIYTRNVCWCHGFPITREAESDD

  19. 2-Identification des protéines par spectrométrie de masse Identification des protéines dans un mélange complexe Digestion in-gel découpage Identification par spectrométrie de masse LC/MS/MS Compilation et élimination de la redondance

  20. 2-Identification des protéines par spectrométrie de masse trypsine dénaturation Protéines Peptides 24 cm Strip IPG pH 3.5 pH 10 électrophorèse 32 morceaux Compilation et élimination de la redondance Identification par spectrométrie de masse LC/MS/MS

  21. Digestion in-gel Carte peptidique séquence peptidique 2-Identification des protéines par spectrométrie de masse Identification systématique des protéines d’un protéome Identification par MS Attention à l’overlapping Rapide Peu coûteux

  22. 3-Quantification des protéines Comparaison de l’abondance des protéines entre des états physiologiques différents synthèse abondance dégradation synthèse abondance dégradation modification modification • Quantification relative par électrophorèse • Quantification relative spectrométrie de masse • Marquage isotopique • SILAC • ICAT • iTRAQ • Label Free • Quantification absolue par spectrométrie de masse

  23. 3-Quantification des protéines • Quantification relative par électrophorèse bidimensionnelle F1 F2 Identification par MS Carte peptidique Séquence peptidique

  24. I MS m/z 3-Quantification des protéines La spectrométrie de masse n’est pas quantitative p Peptides équimolaires 1 Protéine Digestion

  25. I MS m/z 3-Quantification des protéines La spectrométrie de masse n’est pas quantitative et pourtant … p Peptides équimolaires 1 Protéine Digestion Peptide p 14N Peptide p 15N 1:10 1:1 1:2 I I I MS MS MS m/z m/z m/z

  26. 3-Quantification des protéines La comparaison par marquage isotopique et analyse MS échantillon SILAC ICAT protéine Marquage isotopique Digestion trypsique peptide iTRAQ Spectrométrie de masse

  27. H2N-CH-CO-NH-CH-CO-NH-… R1 R2 117 114 116 115 + + + + 29 31 28 30 145 145 145 145 3-Quantification des protéines iTRAQ® : isobaric tags for relative and absolute quantification Groupement réactif O O N N N O O H3C reporter balance

  28. t0 T0+20 min T0+40 min T0+60 min protéine protéine protéine protéine protéolyse protéolyse protéolyse protéolyse Marquage iTRAQ 114 Marquage iTRAQ 115 Marquage iTRAQ 116 Marquage iTRAQ 117 3-Quantification des protéines iTRAQ® : isobaric tags for relative and absolute quantification Mélange

  29. peptide peptide peptide peptide balance balance balance balance reporter reporter reporter reporter 3-Quantification des protéines iTRAQ® : isobaric tags for relative and absolute quantification MS intensité 114 31 m/z MS/MS 115 30 intensité 116 29 m/z 116 115 117 28 intensité 117 114 m/z

  30. 3-Quantification des protéines Label Free LC/MS/MS C18 quantité temps de rétention MS MS MS MS intensité m/z m/z m/z m/z

  31. 3-Quantification des protéines Label Free MS MS MS MS intensité m/z m/z m/z m/z intensité Même temps de rétention

  32. 3-Quantification des protéines Label Free Échantillon 1 intensité Même temps de rétention Échantillon 2 intensité Même temps de rétention

  33. 3-Quantification des protéines La quantification absolue : AQUA® Protéines dont protéine P à doser protéolyse Peptides dont peptide p de la protéine p Peptide p marqué par un isotope stable (quantité connue) Analyse par LC/MS/MS Peptide p Peptide p AQUA® MS m/z

  34. 3-Caractérisation des protéines Modification post-traductionnelle Complexe protéique Agglomérats

  35. 3-Caractérisation des protéines • Le système double hybride • Blue Native / SDS-PAGE • Co-immunoprécipitation • Far Western • Purification : • -Pull down • -Purification des interactants par chromatographie d’affinité • -Co-purification : TAP-tag • Puce à protéine • Phage display • Complémentation de fluorescence bimoléculaire (BiFC) • Transfert d’énergie de fluorescence par résonance • Résonance plasmonique des surfaces Complexe protéique

  36. 3-Caractérisation des protéines Le système double hybride TA TA DB DB Gal4p active la transcription de GAL1 et GAL10 Gal4p promoteur reporteur signal

  37. 3-Caractérisation des protéines Le système double hybride TA Y Y + X X DB promoteur reporteur signal

  38. 3-Caractérisation des protéines Complexes membranaires Principe BN/SDS-PAGE Détergent neutre BN-PAGE BN-PAGE SDS-PAGE pH dessalage 1ère dimension Bleu de Coomassie Gradient Équilibration SDS Mercaptant 2ème dimension Complexes cytosoliques

  39. 4% 18% 7% 12 % complexes hétéromultimériques cytosoliques 3-Caractérisation des protéines

  40. 3-Caractérisation des protéines La co-immunoprécipitation + Protéine A sépharose Anticorps spécifique de Extrait SDS-PAGE Identification par spectrométrie de masse

  41. GST GST GST GST GST GST GST GST GST Glutathion sépharose Glutathion sépharose 3-Caractérisation des protéines Le Pull Down GST + lysat SDS-PAGE Identification par spectrométrie de masse GST Variantes : -fixation préalable de la protéine de fusion sur la colonne de Glutathion séparose -autres étiquettes : 6His, Streptavidine, HaloTag, …

  42. 3-Caractérisation des protéines La purification des interactants par chromatographie d’affinité lysat NHS activated sepharose™ SDS-PAGE Identification par spectrométrie de masse

  43. IgG Sepharose CalmodulineSepharose 3-Caractérisation des protéines La co-purification : TAP-Tag Site de clivage de la protéase du TEV Calmoduline Binding Peptide Protéine appât Fragment ZZ de la protéine A 2 3 1

  44. 3-Caractérisation des protéines Le phage display Banque de phage M13 avec PIII rec ou PVIII rec Sélection Elution Lavage Amplification et re-sélection

  45. 3-Caractérisation des protéines Le Far Western Découpage de la zone Transfert sur membrane Incubation avec la protéine appât Incubation avec l’anticorps dirigé contre la protéine appât Révélation avec un anticorps secondaire Renaturation Identification par spectrométrie de masse

  46. 1 154 Protéine A Linker NYFP 155 233 Protéine B Linker CYFP 3-Caractérisation des protéines Complémentation de fluorescence bimoléculaire (BiFC)

  47. X 3-Caractérisation des protéines Transfert d’énergie de fluorescence par résonance FRET Y Y X

  48. Intensité Angle 3-Caractérisation des protéines Résonance plasmonique des surfaces Canal Puce avec film d’or Lumière réfléchie Prisme Lumière polarisée Unité de détection optique Source de lumière

  49. 3-Caractérisation des protéines Puce à protéine

  50. 3-Caractérisation des protéines Problème récurrent en bioproduction Mise au point du process de production Agglomérats Mesure de la masse du produit purifié

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