Lisa M.Mehlmann

1. „Oocyte-specific expression of Gpr3 is required for maintenance of meiotic arrest in mouse oocytes.” Lisa M.Mehlmann „Ekspresja Gpr3 w oocycie jest wymagana do utrzymania bloku mejotycznego w oocytach myszy” Monika Ostrowska

2. Oocyty • oocyt+komórki pęcherzykowe= pęcherzyk jajnikowy • Oocyty zatrzymane są w profazie I • utrzymanie profazy zależy od wysokiego poziomu cAMP • oocyty,które zakończyły okres wzrostu i zasiedlają duże pęcherzyki z formującą się jamką nabywają zdolność do zapłodnienia • wznawiają mejozę w odpowiedzi na wyrzut hormonu LH.. • LUB zrobią to samorzutnie jeśli usunie się je z pęcherzyka jajnikowego

3. Jak powstaje cAMP? ? • Receptor GPR3 stymuluje białko Gs • aktywne białko Gs stymuluje cyklazę adenylową • aktywność cyklazy adenylowej powoduje wzrost cAMP • cAMP aktywuje kinazę A • ...ciąg przekazywania informacji.. • hamowanie kompleksu cyklinaB -CDK1 • oocyt utrzymany w profazie I

4. Co wiemy o GPR3.. • Jest receptorem połączonym z białkiem Gs • ekspresja Gpr3 mRNA zachodzi zwłaszcza w oocycie, ALE także,choć na niższym poziomie, w otaczających go komórkach pęcherzykowych (GPR3 jest zlokalizowane w oocycie, ale także prezentowane wszędzie w pęcherzyku) • Odpowiedzialny za produkcje cAMP w oocycie (co najmniej w dużej części)

5. GPR3 w oocycie czy w otaczających go komórkach pęcherzykowych jest niezbędny do utrzymania bloku mejotycznego w oocycie?

6. Interferencja RNA • Do oocytów w pęcherzykach jajnikowych wstrzyknięto małe dwuniciowe interferujące RNA- siRNA • RNA było skierowane przeciwko Gpr3 • zapoczątkowało to sekwencjo-specyficzną degradację mRNA • cel: redukcja mRNA kodującego Gpr3 w oocytach

7. Doświadczenie IMikroiniekcja siRNA nakierowanego na Gpr3 do oocytów otoczonych pęcherzykiem • Grupy: - 50nM Gpr3 siRNA - 5nM Gpr3 siRNA - 100nM mutGpr3 siRNA - 100nM GAPDH siRNA - kontrola- bez mikroiniekcji • oocyty w pęcherzykach bez jamki (140-180mikrom średnicy) • czas hodowli 3dni • izolacja,podział na GV i GVBD, liczenie

8. Wyniki • GVBD : • kontrola - 2% • 5nM Gpr3 siRNA - 15% • 50nM Gpr3 siRNA - 67% • mutGpr3 siRNA - 5% • GAPDH siRNA - 0% • 64% oocytów GVBD z Gpr3 siRNA wyrzuciło ciałko kierunkowe

9. Wnioski • redukcja Gpr3 RNA w obrębie mysiego oocytu powoduje wznowienie mejozy • wznowienie podziału mejotycznego w oocytach z Gpr3 siRNA było dozo-zależne

10. Doświadczenie IIRT-PCR • Grupy oocytów: - z Gpr3 siRNA - kontrolna - mutGpr3 siRNA • przygotowane jednakowe ilości cDNA • startery nakierowane przeciwko : Gpr3 i rybosomalnego białka L19 – Rpl19

11. Wyniki • Wstrzykniecie Gpr3 siRNA zmniejszyło ilość Gpr3 mRNA do 10 % w stosunku do obecnego w oocytach kontrolnych. • Ilość Rpl 19 mRNA-niezmieniona. • mutGpr3 siRNA nie zmniejszyło ilości Gpr3 mRNA

12. Wnioski • RNAi nakierowane na Gpr3 jest specyficzne. • Mikroiniekcja Gpr3 siRNA powoduje skuteczną redukcje Gpr 3 RNA w oocytach w pęcherzykach jajnikowych u myszy.

13. Doświadczenie IIIMikroiniekcja siRNA nakierowanego na Gpr3 do oocytów izolowanych/ RT-PCR • Grupy oocytów: - 50nM Gpr3 siRNA - kontrola • hodowano w obecności 4nM hypoksantyny, przez 26-45h • izolacja,podział na GV i GVBD, liczenie • RT-PCR jak poprzednio

14. Wyniki • 16% izolowanych oocytów wznowiło mejozę < jest to znacznie mniej w porównaniu z 67% w pęcherzykach> • redukcja Gpr3 mRNA mniejsza niż u oocytów w pęcherzykach

15. Wnioski • RNAi powoduje wznowienie mejozy i redukcję Gpr3 mRNA w izolowanych oocytach ale w mniejszym stopniu niż w zamkniętych w pęcherzykach oocytach • RNAi jest bardziej efektywna w oocytach otoczonych pęcherzykiem • ograniczony czas hodowli oocytów wyizolowanych- nie wystarczający do obniżenia ilości białka Gpr3 wcześniej-istniejącego i efektywnego zredukowania mRNA

16. Powiązanie z poprzednimi doświadczeniami • 70% GVBD obserwowanych po iniekcji siRNA do oocytu to bardzo blisko do 80-90% zaobserwowanych przy usunięciu Gpr3 RNA z zarówno oocytu jak i komórek pęcherzykowych u myszy z knockout-em Gpr3 • zdolność do utrzymania profazy I w oocycie u myszy z knockout-em Gpr3 może być uratowana jeśli przeprowadzimy mikroiniekcję RNA kodującego Gpr3 do oocytu otoczonego pęcherzykiem

17. Podsumowanie • Redukcja GPR3 specyficznie w oocycie otoczonym pęcherzykiem powoduje wznowienie mejozy • utrzymanie bliku mejotycznego jest zależne od obecności GPR3 w oocycie • metoda redukcji RNA w pęcherzykach jajnikowych, które mogą być hodowane przez czas wystarczający do redukcji endogenicznych białek, powinna znaleźć zastosowanie w stosunku do wielu innych białek, które mogą być zaangażowane w zatrzymanie mejozy, wznowienie mejozy, zapłodnienie czy wczesny rozwój zarodkowy

18. Podsumowanie cz.2 • Jest możliwe, że komórki pęcherzykowe mogą produkować cAMP i dostarczać go przez „gap junctions” do oocytu ...ALE ilość produkowanego przez nie cAMP jest niewystarczająca do utrzymania stanu zatrzymania mejozy-za to odpowiada cAMP produkowane przez oocyt • mimo to oocyt oddzielony od pęcherzyka spontanicznie wznawia mejozę...dlaczego? Hipoteza: komórki pęchrzykowe wysyłają sygnały pobudzające Gpr3 do aktywności. (hipoteza niepotwierdzona)

19. Dziękuje za uwagę